- 年份
- 2024(1204)
- 2023(1582)
- 2022(1320)
- 2021(1156)
- 2020(1075)
- 2019(2262)
- 2018(2248)
- 2017(3729)
- 2016(2586)
- 2015(2894)
- 2014(2838)
- 2013(2835)
- 2012(2725)
- 2011(2461)
- 2010(2461)
- 2009(2223)
- 2008(2240)
- 2007(2134)
- 2006(1849)
- 2005(1644)
- 学科
- 济(6492)
- 经济(6479)
- 业(5277)
- 学(4440)
- 管理(3841)
- 农(3565)
- 农业(2985)
- 中国(2801)
- 企(2684)
- 企业(2684)
- 劳(2432)
- 劳动(2429)
- 动力(2327)
- 劳动力(2153)
- 方法(2139)
- 人口(2137)
- 农业劳动(2008)
- 农业人口(1970)
- 水产(1904)
- 动物(1735)
- 数学(1694)
- 数学方法(1664)
- 财(1565)
- 地方(1521)
- 动物学(1519)
- 关系(1478)
- 及其(1364)
- 融(1249)
- 金融(1247)
- 害(1235)
- 机构
- 大学(37614)
- 学院(36710)
- 研究(17677)
- 农(16094)
- 科学(14778)
- 农业(13237)
- 中国(11500)
- 所(11328)
- 业大(10811)
- 研究所(10593)
- 济(10516)
- 经济(10281)
- 京(8718)
- 室(8714)
- 农业大学(8649)
- 实验(8237)
- 管理(8183)
- 实验室(8025)
- 重点(7615)
- 中心(7386)
- 业(7236)
- 理学(7139)
- 理学院(6949)
- 省(6900)
- 技术(6644)
- 管理学(6590)
- 管理学院(6541)
- 科学院(6340)
- 江(6285)
- 院(6040)
共检索到56212条记录
发布时间倒序
- 发布时间倒序
- 相关度优先
文献计量分析
- 结果分析(前20)
- 结果分析(前50)
- 结果分析(前100)
- 结果分析(前200)
- 结果分析(前500)
[期刊] 华北农学报
[作者]
庞峰 龙琴琴 梁绍波
旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析；在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下，于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞，提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因，确定ORFV113的动态转录水平；以ORFV-JS株基因组为模板，PCR扩增ORFV113基因，将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-ORFV113重组质粒，经酶切、测序鉴定正确后，使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞，通过Western Blotting鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达；将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞，24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色，倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明，ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守，属于ORFV早期基因；成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒，ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达，大小为60～70 ku,比预测分子量大10～20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰；亚细胞定位研究表明，ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上，本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王宪军 向华 张旭梅 任玉鹏 朱江江
旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上，成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞，Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性；流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响；RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平，并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示，成功扩增ORFV118基因，全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平；可抑制细胞的凋亡作用，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平；对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用，而对IL-6和TNF-α呈促进作用。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李小凤 阮志华 石勇丽 武晓倩 韦悠 万丽军 谢志勤 任红玉 谢芝勋
【目的】分析血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Ⅷ蛋白（Protein Ⅷ，pⅧ）对宿主天然免疫相关基因表达的影响，为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒（试验组）和pEF1α-HA空质粒（对照组）转染LMH细胞，利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况，实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-ΚB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框（ORF）全长744 bp，共编码247个氨基酸残基，真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应，在34 kD处得到单一条带；间接免疫荧光检测可见绿色荧光，说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比，Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后，模式受体STING基因的表达水平显著提高了5.6倍（P<0.05，下同），MDA5基因的表达水平提高了30%；接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高了1.5和2.4倍；转录因子IRF7的表达水平显著提高了3.4倍，而NF-ΚB基因被抑制表达。同时，干扰素（IFN-α和IFN-β）和白介素（IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的表达水平均上调，IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍（P
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
朱若林 沈娇娇 蒋书东 杨彩桥 张晓华 鲍传和 彭开松
为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈珍珍 曾显成 池雪林 白丁平 刘云辉 胡可慧 罗树红 黄小红
本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.
关键词：
羊口疮病毒 ORF080蛋白 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨小玲 季静 王罡
将带有目的基因SeNHX1、GFP的酵母表达载体pYES2-SeNHX1、pYES2-GFP、pYES2-SeNHX1-GFP分别导入nhx1酵母缺失型菌株296H,用共聚焦荧光显微镜观察SeNHX1表达蛋白的亚细胞定位;通过菌株在含盐培养基中生长状况研究该蛋白对Na+的解毒功能。结果表明,296H(pYES2-GFP)菌株的绿色荧光弥散于整个细胞质,而296H(pYES2-SeNHX1-GFP)菌株的绿色荧光包围于液泡膜的一圈,因此,SeNHX1蛋白定位于液泡膜;296H(pYES2-GFP)和296H缺陷型菌株在含0.5 mol/L NaCl的培养基中生长受到抑制;带有SeNHX1目的基因...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘自敏 王小朋 白彩霞 杨侃侃 张学琪 胡子慧 孙裴 王勇
为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
胡守彬 赵钦 赵菲菲 肖一红 周恩民
【目的】为获得禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)中国分离株(CaHEV)ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析【。方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位...
[期刊] 水产学报
[作者]
曹书华 魏茂乐 李永仁 黄博闻 辛鲁生 白昌明 王崇明
牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列，根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果，选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后，利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后，将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示，实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体，通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明，表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染，共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体，其中，ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达，为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作，以及病毒入侵机制研究奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
彭浩然 蒲运丹 张永至 薛杨 武改霞 青玲 孙现超
【目的】前期研究显示To MV外壳蛋白(coat protein,CP)可以与烟草蛋白L(CP-interacting protein-L,IP-L)相互作用,本研究旨在明确To MV CP与IP-L的共定位情况、IP-L的组织表达和在To MV侵染条件下烟草IP-L及其编码蛋白的表达变化情况,为进一步明确IP-L的功能提供依据。【方法】通过双酶切法从笔者实验室构建保存的p GBKT7-CP和p GADT7-IP-L重组载体上切下To MV CP和IP-L目的片段,构建融合蛋白植物表达载体p PZP-IP
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
宋春 杨美 岳筠 单春兰 王开功 程振涛
通过SOE-PCR技术获得PstS基因全长并克隆到pColdⅠ,将重组表达载体pCold-PstS转化进BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白PstS,将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清，提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白，通过Western blot分析PstS蛋白的亚细胞定位.结果表明，PstS基因长度为1 065 bp,其蛋白在氨基酸9～31之间存在跨膜区，pCold-PstS经诱导表达获得融合蛋白PstS(存在于细胞膜和胞浆中),其约43 ku并具有较好的抗原性. PstS蛋白是鸡毒支原体膜表面的免疫原性蛋白，可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据.
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
盛佳璐 宗乾坤 喻飞 王浩 吕利群
草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。
文献操作()
导出元数据
文献计量分析
导出文件格式：WXtxt
删除
