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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈珍珍 曾显成 池雪林 白丁平 刘云辉 胡可慧 罗树红 黄小红
本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.
关键词：
羊口疮病毒 ORF080蛋白 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘自敏 王小朋 白彩霞 杨侃侃 张学琪 胡子慧 孙裴 王勇
为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李娜 李恩杰 王青华 王玉珠 张永安 段立清
[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组质粒p GEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与p GEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38. 2 k Da。优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1. 0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4 h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高。[结论]成功构建了p GEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 华北农学报
[作者]
李波 倪志勇 范玲
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...
[期刊] 华北农学报
[作者]
姜楠 郑倩倩 李倩文 涂健 宋祥军 邵颖 刘红梅 祁克宗
兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
薛霜 独军政 高闪电 常惠芸
利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
文征宇 侯文韬 杨龙雨 陈鹏
【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表...
关键词：
牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
夏立群 张红莲 梁海鹰 刘森林
新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优...
[期刊] 华北农学报
[作者]
庞峰 龙琴琴 梁绍波
旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析；在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下，于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞，提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因，确定ORFV113的动态转录水平；以ORFV-JS株基因组为模板，PCR扩增ORFV113基因，将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-ORFV113重组质粒，经酶切、测序鉴定正确后，使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞，通过Western Blotting鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达；将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞，24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色，倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明，ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守，属于ORFV早期基因；成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒，ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达，大小为60～70 ku,比预测分子量大10～20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰；亚细胞定位研究表明，ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上，本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 张文文 王东田 周忠涛 张雪寒 周俊明 汪伟 倪艳秀 温立斌
为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到原核表达载体pcoldI上,构建表达载体pcold-ORF1,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF1融合蛋白。并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定了pcold-ORF1重组蛋白表达的最佳表达条件。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白在BL21中高效表达,以包涵体形式表达...
关键词：
猪输血传播病毒2型 基因克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵冬敏 黄欣梅 刘宇卓 张敬峰 韩凯凯 谢星星 周晓波 李银
根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。
关键词：
鹅坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
刘林 徐诗英 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 曹广力 薛仁宇 陈辉 贡成良
为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫...
关键词：
草鱼出血病病毒 原核表达 纯化 免疫
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯平 李云章 孙丰廷 屈雷 闫海龙
【目的】克隆分析羊口疮病毒（ORFV）榆林株（ORFV-Yulin）的F1L基因序列，通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因，测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因（rB2L）和 F1L融合基因（cF1L），利用碱基linker连接，通过重叠PCR方法扩增获得ORFV rB2L-linker-cF1L重组基因(rB2Lc-F1L)，将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-r
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