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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
余远迪 牟豪 张阳 郑华 李幸 付利芝
【目的】采用Cre/Loxp基因编辑系统，在羊痘病毒135基因位点插入ORFV外源基因F1L，同时引入标记基因，从而构建重组山羊痘病毒，为临床上预防羊口疮疫苗的设计、研制提供参考。【方法】以pDonor载体为基础，135基因编码区两侧500 bp左右的片段作为上下重组同源臂，中间插入羊口疮病毒F1L基因编码区及标记基因gpt、EGFP、痘病毒早晚期启动子p7.5、p11，并且含有loxp位点，构建同源重组供体质粒命名为pGTPV(135)-ORFV-F1L；并对阳性克隆菌液进行PCR鉴定并测序，经测序正确的菌液接种氨苄LB液体培养基培养过夜，提取去内毒素的质粒并进行双酶切鉴定。山羊痘病毒弱毒株感染永生化山羊睾丸细胞2 h后，重组质粒经脂质体法转染永生化山羊睾丸细胞，观察细胞病变及EGFP标记基因的表达情况；48 h后收获病毒液，反复冻融后离心，盲传3代，通过PCR鉴定目标基因的整合情况，以羊口疮病毒阳性血清为一抗，驴抗山羊IgG为二抗，通过蛋白免疫印迹分析目标基因的表达情况来对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经PCR筛选，成功获得表达羊口疮病毒F1L基因的同源重组供体质粒。经过测序并与目标序列进行比对，结果正确，表明重组质粒成功构建。重组质粒经去内毒素提取后测定浓度并进行双酶切鉴定，结果与预期相符，经鉴定的重组质粒转染山羊睾丸细胞，在48 h后观察到细胞病变及绿色荧光，PCR鉴定结果表明F1L基因整合到重组病毒上。蛋白免疫印迹分析显示，检测到目标蛋白条带，说明重组山羊痘病毒插入的外源基因F1L基因成功表达。【结论】本研究成功地构建了一种在135基因位点表达羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒，并在永生化山羊睾丸细胞中，该重组病毒展现出目的基因的稳定表达。以羊痘病毒弱毒株135基因位点插入羊口疮病毒F1L外源基因，该重组病毒在永生化山羊睾丸细胞中获得，目的基因能稳定表达，成功建立构建135基因位点插入羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王宪军 向华 张旭梅 任玉鹏 朱江江
旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上，成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞，Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性；流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响；RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平，并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示，成功扩增ORFV118基因，全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平；可抑制细胞的凋亡作用，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平；对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用，而对IL-6和TNF-α呈促进作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
颜新敏 张强 吴国华 李健 朱海霞
为探讨鉴别山羊痘病毒和绵羊痘病毒的分子生物学方法,对实验室分离保存的3株山羊痘病毒和2株绵羊痘病毒进行p32基因和GpCR基因扩增、克隆及序列分析。将获得的p32基因序列与GenBank上登陆的羊痘病毒p32基因进行HinfⅠ酶切位点分析表明,所有绵羊痘病毒p32基因在391 bp和691 bp处存在2处酶切位点,而山羊痘病毒仅在688 bp处存在1个酶切位点。将获得的GpCR基因序列与GenBank上登录的31条相应序列进行系统进化树分析发现,根据GpCR基因序列信息可将绵羊痘病毒和山羊痘病毒分成两个独立的进化分枝。这些结果表明,利用p32基因的HinfⅠ酶切位点信息和对GpCR基因进行分子...
[期刊] 华北农学报
[作者]
庞峰 龙琴琴 梁绍波
旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析；在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下，于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞，提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因，确定ORFV113的动态转录水平；以ORFV-JS株基因组为模板，PCR扩增ORFV113基因，将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-ORFV113重组质粒，经酶切、测序鉴定正确后，使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞，通过Western Blotting鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达；将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞，24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色，倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明，ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守，属于ORFV早期基因；成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒，ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达，大小为60～70 ku,比预测分子量大10～20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰；亚细胞定位研究表明，ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上，本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯平 李云章 孙丰廷 屈雷 闫海龙
【目的】克隆分析羊口疮病毒（ORFV）榆林株（ORFV-Yulin）的F1L基因序列，通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因，测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因（rB2L）和 F1L融合基因（cF1L），利用碱基linker连接，通过重叠PCR方法扩增获得ORFV rB2L-linker-cF1L重组基因(rB2Lc-F1L)，将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-r
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张冬峰 郑亚东 骆学农 王晓霞 陈轶霞 李辉 侯俊玲 潘晓梅 刘琼 景志忠 岳城 才学鹏
从甘肃景泰疑似羊痘患病绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,利用PCR技术,克隆糖蛋白orf118基因.比较分析表明,该基因由516个核苷酸组成,编码171个氨基酸,相对分子质量为19500,其碱基组成极不平衡,其中A+T含量占72.48%,G+C含量仅占27.52%.甘肃景泰株orf118基因同绵羊痘病毒TU-V02127株之间的核苷酸同源性最高达99.8%,氨基酸的同源性为100%;与疙瘩皮肤病病毒肯尼亚株和山羊痘病毒G20-LKV株之间的同源性分别为96.5%和94.8%.结构预测结果显示,orf118蛋白为分泌蛋白,具有2个N键连结糖基化位点和1个跨膜区.以上结果表明,orf118蛋白在不...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张冬峰 郑亚东 骆学农 王晓霞 陈轶霞 李辉 侯俊玲 景志忠 才学鹏
从甘肃景泰县疑似患羊痘的绵羊皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增膜蛋白ORF23基因.序列分析表明,该基因由1113个核苷酸组成,编码370个氨基酸,A+T含量占69.90%,G+C含量仅占30.10%.绵羊痘病毒甘肃株ORF23基因与A株、NISKHI株之间的核苷酸同源性分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.4%;与皮肤疙瘩病病毒NW-LW株和山羊痘病毒Pellor株之间的核苷酸同源性均为98.2%.结构预测显示,ORF23膜蛋白为非分泌蛋白,具有一个O连结糖基化位点.可见,ORF23膜蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断研究价值.
关键词：
绵羊痘病毒 ORF23 膜蛋白
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
池雪林 曾显成 黄小红 罗树红 汪世华
通过透射电子显微技术对羊口疮病毒(ORFV)YX强毒株感染羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)的细胞超微结构和病毒形态发生学进行研究.结果显示,成熟的病毒粒子呈椭圆形,有囊膜,大小约为150 nm×250 nm,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和2个侧小体结构.病毒在胞浆中复制,在高尔基体形成囊膜,最后病毒粒子通过细胞膜出芽和细胞裂解方式释放病毒粒子.感染细胞超微结构主要表现为:内质网扩张呈囊、池内分离;线粒体增生、嵴肿胀、变暗、模糊不清,最后空泡化;高尔基体出芽、扩张;细胞核溶解呈早期凋亡现象,胞浆出芽,最后整个细胞裂解、破碎.
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头，串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE，将其克隆到原核表达载体pET-32中，采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒，构建pET32-mE质粒；用IPTG在不同条件下诱导表达，确定最佳表达条件，表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明，重组蛋白是分子质量为41 ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5 mmol/L，温度为37℃、诱导4 h时目的蛋白的表达量最...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黄哲 潘雪义 袁哲明 胡松奇
采用时间—剂量—死亡率模型,分析了粘虫痘病毒(PsEPV)重组增效蛋白P39对棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)感染棉铃虫幼虫的增效作用.结果显示:初步纯化的P39对HaNPV感染棉铃虫3龄幼虫显示了极显著的增效活性,感染后11 d,HaNPV+P39组的LC50(1 082 PIBs/mL)比HaNPV组(13 831 PIBs/mL)降低了92.18%,增效倍数达12.8;HaNPV为1.6×103～1.6×106 PIBs/mL时,P39可缩短LT50 0.5～2.7 d.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
尹彩霞 于少雄 宋琨 李素 杨玉莹 仇华吉
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏良科 范红结 陆承平
采用通用的模式细胞HEp 2作黏附及黏附抑制试验 ,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6株类M蛋白的黏附作用。结果表明 ,ATCC35 2 4 6株可以黏附HEp 2细胞。用重组表达的类M蛋白鼠抗血清处理ATCC35 2 4 6 ,可抑制其对HEp 2细胞的黏附 ,最大抑制率达 81 4 % ;而ATCC35 2 4 6的全菌鼠抗血清在 1∶80 0时能完全抑制它对HEp 2细胞的黏附。此外 ,热酸提取的ATCC35 2 4 6株的类M蛋白和重组表达的类M蛋白可不同程度地抑制该菌株的黏附 ,前者在 16 0μg·mL-1有最大的黏附抑制率 ( 4 0 % ) ,而后者在 6 0 μg·...
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