采用组织块移植法,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肾脏组织细胞进行原代培养,建立了罗非鱼肾脏细胞系,已稳定传代培养50代以上,命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞,其最佳培养基为DMEM,最适培养温度为28℃,最适血清浓度为15%。在最适培养条件下,罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏,经台盼蓝染色,约(89.84±3.48)%的细胞具有活性,复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示,第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20～66之间,众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞,可产生典型的细胞病变效应,表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。

采用组织块移植培养技术,对来源于斑点叉尾(Ictalurus punctatus Rafinesque)肾脏组织的细胞进行原代培养,建立了斑点叉尾肾脏组织细胞系,定名为CCK,目前已稳定传代培养70多次。斑点叉尾肾脏组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为M199,最适培养温度范围为28～32℃,培养基血清体积分数为10%。在此条件下,CCK细胞的倍增时间为38.9～41.0h。斑点叉尾肾脏细胞的集落形成效率为(74.16±3.54)%,第9代传代细胞的染色体数目为正常二倍体2n=58,第33代传代细胞的染色体众数为60。液氮冷冻保存6个月后复苏的细胞经台盼兰染色检验,(86.69±1.0...

为研究鱼类骨组织细胞的特征,实验建立了团头鲂骨组织细胞的体外分离培养方法,并对其生物特性进行了鉴定。以3月龄团头鲂尾椎骨及肋骨为实验材料,利用组织块培养法和胰蛋白消化法分别进行骨组织细胞培养,确定最佳培养条件:采用组织块培养法,28°C培养,M-199培养基中加入体积分数为20%的胎牛血清、25 ng/m L表皮生长因子EGF和25 ng/m L碱性成纤维生长因子b FGF。细胞生物学特性鉴定结果显示:细胞碱性磷酸酶、钙化结节茜素红染色及矿化结节von Kossa氏法染色均呈阳性,表明所培养的细胞具有典型

采用组织块移植培养技术，对来源于青鱼（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ）的鳍条组织细胞进行原代培养，建立了青鱼鳍条组织细胞系，定名为Ｂｃ－Ｆｉｎ。青鱼鳍条组织细胞为成纤维样细胞，已稳定传代培养５０多代，其最适培养温度为２５℃，最佳培养基为ｌ－１５，最适血清浓度为１５％，在最适培养条件下，青鱼鳍条组织细胞的群体倍增时间为６０．６ ｈ。青鱼鳍条组织细胞液氮冷冻保藏６个月后，经台盼蓝染色，约（９０．０９±４．６５）％的细胞具有细胞活性，复苏后的细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示，第１６代青鱼鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体（２ｎ＝４８），第４１代细胞染色体众数为４６。通过对离体培养细胞．．．

为建立永生化山羊子宫内膜上皮细胞系并研究其生物学特性,将人端粒酶逆转录酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)导入原代培养的山羊子宫内膜上皮细胞(Endometrium epithelial cells,EECs),经G418筛选培养,以获得一株永生化山羊子宫内膜上皮细胞(hTERT-EECs);利用流式细胞仪检测其生长周期、凋亡情况及倍体情况;利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测其在半固体培养基中的克隆形成能力;裸鼠致瘤实

【目的】以滩羊胎儿皮肤组织为材料,获得符合体细胞克隆转基因基本要求的供体细胞系。【方法】取滩羊胎儿皮肤组织,采用组织块法分离培养获得滩羊胎儿成纤维细胞,观测其形态和生长情况,鉴定其性别,并对其染色体核型和红色荧光报告基因质粒(pmCherry-N1)转染等生物学特性进行研究。【结果】采用组织块法成功获得了滩羊胎儿成纤维细胞,其细胞群体倍增时间(PDT)约为48h;5代、15代、25代滩羊胎儿成纤维细胞核型分析表明,各代细胞染色体均为2n=54,未见异常;滩羊胎儿成纤维细胞的转染效率较高,约为50%,对最终获得的稳定表达红色荧光蛋白的胎儿成纤维细胞进行核型分析,结果证明遗传物质没有发生变化。【结...

探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。

以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.

采取猪囊尾蚴组织,经过体外培养已建立一株细胞系,命名为猪囊尾蚴 CC-97免疫细胞系.原代培养30d 形成单层细胞,以1:2分种率传代培养,相隔7d 传代一次,连传24次,历时8个月之久.细胞系由三肿类型细胞组成,以椭圆形细胞占优势,梨形、球形者数额略相等.放射自显影法测定细胞分裂、~3H-TdR 显示细胞生长指数,均证明细胞对数增殖期长达7d,细胞生长从12h 开始倍增分裂,第4,5天相继达到倍增分裂高峰,细胞增殖率达11倍,增效达6.32×10~6mL~(-1),细胞周期约32h,细胞系二倍体细胞为主,染色体

为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆...

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,本试验研究了大白猪仔猪(约克夏)皮肤成纤维细胞分离、培养、传代的方法,及其体外生长特征。应用本研究方法,所培养细胞在体外的生长增殖过程呈典型的"S"型。在冷冻、复苏试验中,组织块或细胞经冷冻保存复苏后活率较冻存前有所下降,但大多数细胞仍能正常生长。通过本方法,可以获得能在体外正常传代培养的细胞系,为动物克隆研究提供了供核细胞来源。

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达;RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

采用组织块培养法启动大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏3种组织细胞的原代培养,并稳定传代培养30代、31代和35代。结果发现,用透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶联合消化鳍和吻端组织后细胞分散效果更好。培养于添加5 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mLⅠ型胰岛素样生长因子(IGF-I)及20%胎牛血清的DMEM/F12培养基(pH 7.2)中的3种组织细胞生长分裂旺盛,均为成纤维样细胞。在此条件下第20代的鳍、吻端、肾脏组织细胞群体倍增时间分别为58.7,50.4和32.9 h。第25代大泷六线鱼3种组织细胞的特征性染色体数目均为48条。细胞经液氮冷冻保存60 ...

以文冠果成熟种胚诱导的愈伤组织为材料,进行悬浮培养细胞系的建立及细胞生长特性的研究。结果表明:文冠果细胞悬浮培养的初始接种量在100mL三角瓶40mL液体培养基中以2.0g为宜,最适激素浓度以2,4-D,6-BA,NAA均为0.5mg·L-1为宜,细胞活力在接种第3天时达到最大,细胞分裂指数在接种第10天时达到最大,鲜质量增长量在第14天时达到最大。