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[期刊] 淡水渔业  [作者] 黎娅  罗福广  左跃  易弋  伍时华  杨军  
2012年9月5日广西柳州市某罗非鱼养殖场出现暴发性疾病,从患病罗非鱼的脑组织中分离到1株γ溶血性革兰氏阳性链球菌。通过生理生化试验、基于cfb基因的PCR鉴定及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为无乳链球菌。该菌株为γ溶血性,CAMP试验阴性,与常见无乳链球菌有较大差别。人工感染试验结果显示分离菌株对罗非鱼具有很强的致病性。药物敏感试验结果显示分离菌株对诺氟沙星、多黏菌素B、复方新诺明耐药,对青霉素G等17种药物均敏感。
[期刊] 中国水产科学  [作者] 张德锋  刘礼辉  任燕  李宁求  林强  潘厚军  石存斌  吴淑勤  
2014年海南省文昌市多个养殖场的罗非鱼出现暴发性疾病,患病罗非鱼表现出体色发黑、打转游动、眼球突出或混浊等典型的链球菌病症状。从患病罗非鱼的肝、肾、脾、眼球和脑等组织中分离到19株病原菌,即TC-1、TC-2、BL1441~BL1448和WT1451~WT1459。通过形态观察、生理生化特征和16S r RNA基因序列分析等方法对病原菌进行鉴定,结果表明,这些病原菌均为无乳链球菌。溶血试验结果表明,TC-1、TC-2和BL1441~BL1448菌株为β-溶血性无乳链球菌,而WT1451~WT1459菌株为不溶血无乳链球菌。进一步通过MLST、分子血清型和毒力相关基因检测等技术对这些分离菌株进...
[期刊] 水产学报  [作者] 张新艳  樊海平  钟全福  卓玉琛  林煜  曾占壮  
从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA,将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验,试验感染罗非鱼表现出自然发病症状,确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌。分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16S rRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示,分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支,而海豚链球菌则构成另一分支,确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)。分离菌株对氨苄西林、...
[期刊] 渔业科学进展  [作者] 王蓓  李桂欢  王培  汤菊芬  鲁义善  吴灶和  简纪常  
为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-T...
[期刊] 淡水渔业  [作者] 赵长臣  江小燕  刘春花  张德峰  罗霞  曾伟伟  陈总会  黄志斌  
为查明梭鲈(Lucioperca lucioperca)凸眼病病原,从患病梭鲈病灶眼、肝、脾和肾分离纯化病原菌,进行了生理生化特性测定及16S rRNA基因序列分析,并开展人工感染试验,测定其血清型及MLST分型,并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。结果显示:分离菌株(命名为SL1701株)为本次引发梭鲈病害的致病菌,Ib-ST261型。回归感染实验证实,分离得到的细菌SL1701对健康梭鲈具有非常强的致病性,4.5×105CFU/m L时可使80%受感染梭鲈死亡,并可复制出自然发病鱼的症状。菌株SL1701革兰氏染色为阳性链球菌,γ溶血,生理生化特性与普通无乳链球菌基本一致,16S rRNA基因序列与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)同源性最高,综合判定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。药敏试验结果显示:分离菌株SL1701对氟苯尼考、氟罗沙星等17种抗生素高度敏感,对青霉素、磷霉素等8种抗生素耐药。结果表明,分离菌株SL1701为Ib-ST261型无乳链球菌,养殖时可选用氟苯尼考及氟罗沙星等药物进行防控。
[期刊] 水产学报  [作者] 祝璟琳  李大宇  肖炜  邹芝英  杨弘  
以罗非鱼源无乳链球菌为抗原,免疫新西兰兔获得高效价的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,羊抗兔Ig g-HRP作为酶标二抗,建立无乳链球菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106 CFU/m L和1∶10 000;酶标二抗的最适工作浓度为1∶1000。病原菌检测灵敏度为每孔103 CFU。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应;阻断实验中的阻断率达72.02%;交叉反应和阻断实验的结果显示该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了44株2007—2013年分离的罗非鱼无乳链球菌,阳性检测率为100%;对人工感...
[期刊] 中国水产科学  [作者] 刘观斌  王淼  卢迈新  可小丽  刘志刚  朱华平  高风英  曹建萌  
从尼罗罗非鱼(OreOchrOmis nilOticus)肠道内容物中分离筛选出具有反硝化能力并拮抗无乳链球菌(streptOcOccus agalactiae)的芽孢杆菌好氧菌株,并对其中拮抗性最强的1株芽孢杆菌进行形态学、生理生化特性、16s rrna基因序列鉴定,进一步研究其最适生长条件、水解淀粉和蛋白的能力,并进行菌株药物敏感试验及安全性检测。经鉴定,筛选出的菌株(命名为nY 5)为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在反硝化性能检测培养基中接种1%的nY5菌液后,对50 mg/l的亚硝酸盐氮12 h去除效率达到100%;对本实验室保存的21株不同来源的无乳链球菌均有拮抗作...
[期刊] 华北农学报  [作者] 阚威  王华  马友记  赵兴绪  张勇  
为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取...
[期刊] 中国水产科学  [作者] 祝璟琳  邹芝英  李大宇  肖炜  喻杰  陈炳霖  马文静  杨弘  沈锦玉  
为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果, 本研究采用10%甲醛溶液灭活法对无乳链球菌HN0901和GX1101制备了胞外产物灭活疫苗, 通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂), 在免疫后28 d攻毒同/异源无乳链球菌, 测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价, 并比较了罗非鱼在腹腔注射1×10~(8) CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。结果显示, 免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后28 d显著高于对照组, 但在攻毒后显著低于对照组; 与对照鱼相比, 免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高, 丙二醛(MDA)显著降低(P
[期刊] 水产学报  [作者] 汪开毓  付希  肖丹  黄锦炉  王均  王浩丞  
利用特异性引物,采用PCR扩增出分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株的cpsE基因,将其克隆到pMD19-T载体上,通过菌落PCR鉴定和利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定之后送测序公司测序,并利用生物信息学软件C lustal X 2.0、MEGA4.1、B ioed it 7.0、TMHMM、NetPhos 2.0、NetNG lyc 1.0、SignalP 3.0 Server、PSIpred、SAM_T08以及CUSP等分析cpsE基因的分子特性。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌cpsE编码氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%,具有1个参...
[期刊] 中国水产科学  [作者] 余泽辉  张佳  耿毅  邓梦玲  汪开毓  黄小丽  陈德芳  王均  
2012–2013年四川齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)养殖场流行一种临床特征为突眼、体表出血和神经症状的传染病,在肝、肾涂片检查中发现链状G+球菌。从自然发病齐口裂腹鱼分离到2株形态与涂片检查一致的G+球菌(DML120817,YZH130830),其在脑心浸液培养基(BHI)平板上28℃培养48 h,形成白色圆形、表面光滑、边缘整齐的针尖大小菌落。经人工感染实验证实分离菌株为该病的病原菌。根据分离菌株的形态学和生理生化检测结果初步判定其为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);16S r RNA基因序列分析表明,2分离株(Gen Bank登录...
[期刊] 水产学报  [作者] 祝璟琳  邹芝英  李大宇  肖炜  韩珏  杨弘  
为了解尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后各组织的病理变化,运用革兰氏染色和电镜负染技术对一株从自然发病的尼罗罗非鱼上分离的无乳链球菌进行形态观察,采用组织切片和超薄切片电镜技术对患病尼罗罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑、心肌、骨骼肌、肠、鳃等8种组织进行病理学研究,探讨该病的致病机理。结果显示,革兰氏染色呈阳性,负染后透射电镜观察多数细菌呈链状排列;组织病理学变化主要是各内脏器官的广泛充血、水肿、变性和炎性细胞浸润,严重的细胞坏死;超微病理显示,大量球菌侵染脾脏等内脏组织,破坏细胞结构和各种细胞器;细胞界限模糊,细胞核畸形,线粒体肿大,嵴断裂,溶解;粗面内质网肿大、核糖体脱落;细胞质空泡化严重;心肌和骨骼...
[期刊] 淡水渔业  [作者] 邵辰  易弋  黎娅  黄荷  伍时华  杨军  
根据无乳链球菌(StreptococcuS agalactiae)cfb基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式pcr方法。结果显示:使用该方法对罗非鱼(oreochromiS moSSambicuS)血液样品进行检测,可检测到活菌浓度为8.7×104cfu/m l的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的19份罗非鱼样品进行检测,18份可获得目的片段,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,检测准确度达到94.7%。
[期刊] 水产学报  [作者] 刘志刚  可小丽  卢迈新  朱华平  高风英  
为了解温度对鱼源无乳链球菌毒力的影响机制,本实验研究了温度对无乳链球菌毒力相关参数(生长、粘附、入侵、毒力基因表达以及对罗非鱼致死率)的影响。结果发现,不同培养温度下(25~40℃)无乳链球菌的生长速度不同,37℃为其最适生长温度,25℃时生长速度最慢;25~34℃内无乳链球菌粘附在惰性基质上的菌体对应的吸光值(OD590nm)之间无显著差异(P>0.05),37℃时显著增加,40℃时又急剧下降;罗非鱼在人工感染无乳链球菌后各时间点(6、12、24和48 h),鱼体脑组织中菌量随注射菌体培养温度的增加呈先上升后下降的趋势,且与不同培养温度下的无乳链球菌对罗非鱼的致死率呈正相关;无乳链球菌毒力基...
[期刊] 淡水渔业  [作者] 丁浩  董靖  宋怿  苏志俊  余琳雪  艾晓辉  
为了筛选出对无乳链球菌(Streptococcus agalactiate)有抗菌效果的安全新药物,实验采用琼脂扩散法和微量稀释法测定了36种中药单体对3株罗非鱼致病性无乳链球菌的抑菌活性,测定了血根碱对无乳链球菌生长曲线和生物被膜成膜的影响。结果显示:受试菌株对血根碱、白屈菜红碱、厚朴酚、和厚朴酚和大黄酸极度敏感,抑菌圈均在20 mm以上,5种药物对无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC)为8~32μg/mL,表现出很强的抑制作用,其中血根碱对3株无乳链球菌的最小杀菌浓度(MBC)均为16μg/mL;生长曲线及生物被膜试验发现血根碱对无乳链球菌生长和生物被膜生成具有抑制作用。在不同血根碱浓度下,与其他浓度组相比当血根碱浓度达到16μg/mL及以上时,受试菌株生物被膜的生成率降低到2.76%以下,相同条件下,绿原酸作用下生物被膜生成率均在90%以上。
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