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[期刊] 水产学报
[作者]
陈雪 可小丽 卢迈新 刘志刚 高风英 朱华平 曹建萌
LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李庆勇 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英 刘志刚
以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为鱼体样本,克隆了罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)scpB基因,构建了原核表达质粒pET32a(+)-scpB,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子金属螯合柱纯化及超滤管浓缩后,进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。纯化的重组蛋白以不同剂量(1μg/g、3μg/g、5μg/g)免疫尼罗罗非鱼后,每周检测各实验组鱼体血清非特异性免疫指标[溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力]及抗体水平变化情况,并于免疫4周后以4倍LD50的剂量对其进行人工攻...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王蓓 李桂欢 王培 汤菊芬 鲁义善 吴灶和 简纪常
为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-T...
关键词：
无乳链球菌 溶血素 原核表达 免疫原性
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘鸿艳 张耀光 张松林 沈志强 马永彪
为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32
[期刊] 中国水产科学
[作者]
蒋蔚 刘永杰 陆承平
以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%~95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘家星 汪开毓 陈德芳 刘韬 贺扬 曾宇鲲 蒋洁
为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白ＥＦ－Ｔｕ（延伸因子Ｔｕ，ＥｌｏｎｇａＴｉｏｎ ＦａｃＴｏｒ Ｔｕ）的抗原性，本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３的ＥＦ－Ｔｕ基因序列，并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白，同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白血清以用于ＥＦ－Ｔｕ蛋白抗原性检测。结果显示，罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３ ＥＦ－Ｔｕ基因有１个由１１９７个碱基组成的ｏｒＦ，编码３９８个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为ｃ＿（１９３３）Ｈ＿（３０９６）ｎ＿（５３２）ｏ＿（６１５）Ｓ＿（１１），分子质量为４３．９８１ ｋｕ，理论等．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
丁国伟 李琛 李玉安 叶正琴 宋庆庆
为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
费小战 卢海松 郭红燕 谭亚娣 陈焕春 郭爱珍
将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李庆勇 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英
为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王向柳 王长法 杨少华 杨宏军 阿合买提·买买提 高运东 仲跻峰
提取无乳链球菌的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到PMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768bp的ORF,可编码含256个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成同源性为98.4%。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32 a+/cfb。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
关键词：
无乳链球菌 CAMP因子 克隆 表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄辉 毛芝娟 陈吉刚
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李桂伟 乔薪瑗 刘伯臣 马广鹏 刘敏 刘力威 李一经
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吉尚雷 张培军 卢玉婷 王建超 李月红
【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分...
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