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[期刊] 中国水产科学
[作者]
李庆勇 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英 刘志刚
以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为鱼体样本,克隆了罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)scpB基因,构建了原核表达质粒pET32a(+)-scpB,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子金属螯合柱纯化及超滤管浓缩后,进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。纯化的重组蛋白以不同剂量(1μg/g、3μg/g、5μg/g)免疫尼罗罗非鱼后,每周检测各实验组鱼体血清非特异性免疫指标[溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力]及抗体水平变化情况,并于免疫4周后以4倍LD50的剂量对其进行人工攻...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李庆勇 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英
为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈雪 可小丽 卢迈新 刘志刚 高风英 朱华平 曹建萌
LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王蓓 李桂欢 王培 汤菊芬 鲁义善 吴灶和 简纪常
为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-T...
关键词：
无乳链球菌 溶血素 原核表达 免疫原性
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
郑宗林 汪开毓 肖孟玮 王均 李岚敏 贺扬 陈德芳 黄凌远
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70ku和27ku,浓度达到6.4mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾后第3周抗体水平开始增加,第4周...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王向柳 王长法 杨少华 杨宏军 阿合买提·买买提 高运东 仲跻峰
提取无乳链球菌的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到PMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768bp的ORF,可编码含256个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成同源性为98.4%。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32 a+/cfb。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
关键词：
无乳链球菌 CAMP因子 克隆 表达
[期刊] 水产学报
[作者]
刘家星 汪开毓 陈德芳 刘韬 贺扬 曾宇鲲 蒋洁
为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白ＥＦ－Ｔｕ（延伸因子Ｔｕ，ＥｌｏｎｇａＴｉｏｎ ＦａｃＴｏｒ Ｔｕ）的抗原性，本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３的ＥＦ－Ｔｕ基因序列，并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白，同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白血清以用于ＥＦ－Ｔｕ蛋白抗原性检测。结果显示，罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３ ＥＦ－Ｔｕ基因有１个由１１９７个碱基组成的ｏｒＦ，编码３９８个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为ｃ＿（１９３３）Ｈ＿（３０９６）ｎ＿（５３２）ｏ＿（６１５）Ｓ＿（１１），分子质量为４３．９８１ ｋｕ，理论等．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
丁国伟 李琛 李玉安 叶正琴 宋庆庆
为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘鸿艳 张耀光 张松林 沈志强 马永彪
为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李桂伟 乔薪瑗 刘伯臣 马广鹏 刘敏 刘力威 李一经
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
祝璟琳 邹芝英 李大宇 肖炜 喻杰 陈炳霖 马文静 杨弘 沈锦玉
为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果， 本研究采用10%甲醛溶液灭活法对无乳链球菌HN0901和GX1101制备了胞外产物灭活疫苗， 通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂)， 在免疫后28 d攻毒同/异源无乳链球菌， 测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价， 并比较了罗非鱼在腹腔注射1×10~(8) CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。结果显示， 免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后28 d显著高于对照组， 但在攻毒后显著低于对照组; 与对照鱼相比， 免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高， 丙二醛(MDA)显著降低(P
[期刊] 水产学报
[作者]
吴斌 樊海平 张新艳 郑磊 钟全福 张国庆 翁祖桐
为了建立罗非鱼无乳链球菌病免疫防控方法，以原核表达ＳＩＰ（Ｓｕｒｆａｃｅ ＩｍｍｕｎｏｇｅｎＩｃ ＰｒｏｔｅＩｎ）蛋白为芯材，天然多糖为壁材，制备罗非鱼无乳链球菌聚丙烯酸树脂Ⅱ微胶囊口服疫苗，ＳＩＰ口服疫苗微胶囊颗粒平均直径约８２６．５μｍ，包封率为７２．０２％，载药量最高达６．１１％。微胶囊包裹的ＳＩＰ蛋白在５种缓冲液中释放效果：Ｐ Ｈ ６．８０＞Ｐ Ｈ ７．２０＞Ｐ Ｈ ９．１８＞Ｐ Ｈ４．６８＞Ｐ Ｈ ２．００。体外实验证实微胶囊颗粒在模拟胃酸环境中蛋白释放量极小，数值为３９５．５μｇ；而在模拟肠液中，释放量最高达５４２６．０μｇ，其中２４０ ｍＩｎ释放量为４９１１．１μｇ，释放度达９０．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
王蓓 简纪常 鲁义善 蔡双虎 黄郁葱 汤菊芬 李桂欢 吴灶和
为了对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株毒力相关转录调控因子rovS进行克隆及表达研究,实验根据GenBank上登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的rovS基因,然后将该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果显示,该基因有849个碱基,编码282个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2 603 V与ATCC13813的rovS基因的同源性最高;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为34 ku;用亲和层析后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测效价达到1∶51...
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