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[期刊] 淡水渔业
[作者]
邵辰 易弋 黎娅 黄荷 伍时华 杨军
根据无乳链球菌（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＳ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ｃｆｂ基因序列，设计、合成２对引物，优化扩增条件，建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式ｐｃｒ方法。结果显示：使用该方法对罗非鱼（ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉＳ ｍｏＳＳａｍｂｉｃｕＳ）血液样品进行检测，可检测到活菌浓度为８．７×１０４ｃｆｕ／ｍ ｌ的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的１９份罗非鱼样品进行检测，１８份可获得目的片段，扩增到的序列均为无乳链球菌ｃｆｂ基因序列，检测准确度达到９４．７％。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘婵 冯娟 谢云丹 胡万涛 王江勇 苏友禄
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)作为罗非鱼主要病原,传染力强、致死率高,部分鱼从发病到死亡无明显病症,难以确定鱼体是否携带该病原菌,建立适用于生产一线的无乳链球菌检测技术势在必行。根据GenBank中无乳链球菌透明质酸酶基因(hylB)、青霉素结合蛋白基因(pon A)和CAMP因子基因(cfb)的保守序列,设计3对特异性引物,对多重PCR的反应条件和体系进行优化,建立基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法,并运用该方法检测来自广东省不同地区的罗非鱼组织样品。构建的三重PCR检测方法仅在无乳链球菌中扩增出3条特异性条带,而在罗非鱼和常见的水产病原菌菌株中均未扩增出任何条带,表现出良好的特异性;以无乳链球菌基因组DNA浓度7.24×10~(–5)~5.65 ng/μl为模板进行扩增,该三重PCR能检测到的最低模板浓度为1.81×10~(–3) ng/μl,表现出较高的灵敏度;运用该方法检测188个罗非鱼组织样品,其阳性检出率与常规细菌分离鉴定阳性率一致,以常规细菌分离鉴定为标准,对该三重PCR检测方法进行评价,其诊断敏感性(Dse)和诊断特异性(Dsp)均为100%。结果表明,构建的三重PCR检测方法不仅显著提高了检测的准确度和灵敏度,还可在同一反应中同时检测3种无乳链球菌毒力基因,为无公害水产品中无乳链球菌的快速检疫、水产养殖病害早期预警提供了一种快速、精准和高效的检测技术。
关键词：
罗非鱼 无乳链球菌 毒力基因 三重PCR
[期刊] 水产学报
[作者]
祝璟琳 李大宇 肖炜 邹芝英 杨弘
以罗非鱼源无乳链球菌为抗原，免疫新西兰兔获得高效价的多克隆抗体；以此多克隆抗体作为一抗，羊抗兔Ｉｇ ｇ－ＨＲＰ作为酶标二抗，建立无乳链球菌的间接ＥＬＩＳＡ快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为１０６ ＣＦＵ／ｍ Ｌ和１∶１０ ０００；酶标二抗的最适工作浓度为１∶１０００。病原菌检测灵敏度为每孔１０３ ＣＦＵ。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性，与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应；阻断实验中的阻断率达７２．０２％；交叉反应和阻断实验的结果显示该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了４４株２００７—２０１３年分离的罗非鱼无乳链球菌，阳性检测率为１００％；对人工感．．．
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
甘西 陈明 余晓丽 李莉萍 陈汉忠 徐增辉 雷爱莹 梁万文 黄维义
为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测。结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20~30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致。该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用...
关键词：
海豚链球菌 PCR 罗非鱼 诊断
[期刊] 华北农学报
[作者]
王永 赵新 景海春 兰青阔 朱珠 程奕
以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作。结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当。所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昆丽 林本夫 席振军 杨冬霞 卞志标 宋帅 蒋智勇 蔡汝健 李春玲
为了建立一种高效、灵敏的猪链球菌(SS)检测方法,针对SS的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)合成特异性引物,通过优化退火温度与引物浓度,经特异性、敏感性、重复性以及临床样品检测,建立了SS的纳米PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅能从SS的基因组序列中扩增得到687 bp的特异性序列,与猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌无交叉反应,且能同时识别1、2、7和9型4个目前流行的SS主要血清型,满足临床上多血清型SS感染检测的需要;敏感性试验结果显示,该方法对SS的最低检测下限为10 cfu/mL,与普通PCR方法相比,灵敏度提高了100倍;重复性试验表明,该方法检测效果稳定,重复性较好。用该方法和普通PCR对临床上收集的44份疑似SS感染样品进行检测,阳性率分别为72.7%(32/44),54.5%(24/44),表明该纳米PCR方法具有灵敏度高,特异性好等优点。综上,本研究建立的SS纳米PCR检测方法,能够准确、高效检测SS,为猪链球菌病的临床诊断和流行病学调查提供了技术支持。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
拜廷阳 杨增岐 吴志明 普志平 赵明军 闫若潜
【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
杨明伟 韦慕兰 罗福广 黎姗梅 黄立春 李明 吕小丽 王强 米强 梁静真 黄钧
【目的】开展罗非鱼源无乳链球菌的氨基糖苷类抗生素耐药性及耐药基因的检测分析,为临床用药指导和该菌的耐药机制的进一步研究提供理论基础。【方法】通过K-B纸片扩散法对32株无乳链球菌菌株进行氨基糖苷类抗生素的敏感性试验,采用PCR法检测4种氨基糖苷类耐药基因的携带情况。【结果】32株无乳链球菌对链霉素、庆大霉素和新霉素的耐药率依次是100. 0%、100. 0%及78. 1%。新霉素在南宁市、玉林市和柳州市的耐药率依次为87. 5%、100. 0%及53. 8%,差异显著(P 0. 05)。所检无乳链球菌中同时携带ant(3’)-I和aac(6’)-Ib基因的菌株占28. 1%(9/32),只携带其中1种耐药基因的菌株占50. 0%(16/32),未检出耐药基因的菌株占21. 9%(7/32)。链霉素耐药表型与ant(3’)-I基因符合率为75. 0%,新霉素、庆大霉素和链霉素耐药表型与aac(6’)-Ib基因的符合率依次为36. 0%、31. 3%及31. 3%,新霉素耐药表型与aph(3’)-Ia基因符合率为0. 0%,庆大霉素和新霉素耐药表型与aac(3’)-Ib基因的符合率均为0. 0%。【结论】广西罗非鱼源无乳链球菌对庆大霉素、链霉素及新霉素的耐药率均较高。罗非鱼源无乳链球菌的氨基糖苷类耐药基因以ant(3’)-I为主,链霉素耐药表型与ant(3’)-I基因之间的符合率最高,其次为新霉素、庆大霉素和链霉素耐药表型与aac(6’)-Ib基因的符合率,新霉素耐药表型与aph(3’)-Ia基因、新霉素和庆大霉素耐药表型与aac(3’)-Ib基因的符合率最低。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙国荣 马少鸿 林桂香 万小菊 黄郁葱 简纪常 蔡双虎
基于荚膜多糖cpsA基因设计引物，建立海豚链球菌可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，以快速检测鱼类养殖中的海豚链球菌。结果表明，LAMP最佳反应条件为65 ℃反应20 min，镁离子浓度为1.2 mmol/L、dNTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为 16:1；特异性检测结果表明：该方法能特异性检出海豚链球菌，对无乳链球菌和其他14种菌检测结果均呈阴性；灵敏度检测结果表明，该LAMP方法灵敏度为21.2×10~(-6) ng/μL，比PCR检测方法灵敏度高100倍；适用性分析结果表明，该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。
关键词：
海豚链球菌cpsA LAMP 可视化检测
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘春生 徐耀辉 陈陆 刘春明 王新娟 高冬生 王永生 张九州 王川庆
【目的】建立致病性猪链球菌种及其1、2、7型的快速多重PCR检测方法,并进行初步的临床应用。【方法】根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及其1(14)、2(1/2)、7型特异的cps1I、cps2H、cps7H基因序列,分别设计4对引物,通过对单个基因PCR和多重PCR扩增条件、反应体系的优化,建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的4重PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株,对建立的多重PCR方法进行特异性和敏感性试验。用所建立的4重PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品的PCR产物进行测序验证。【结果】所...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘家星 汪开毓 陈德芳 刘韬 贺扬 曾宇鲲 蒋洁
为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白ＥＦ－Ｔｕ（延伸因子Ｔｕ，ＥｌｏｎｇａＴｉｏｎ ＦａｃＴｏｒ Ｔｕ）的抗原性，本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３的ＥＦ－Ｔｕ基因序列，并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白，同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗ＥＦ－Ｔｕ重组蛋白血清以用于ＥＦ－Ｔｕ蛋白抗原性检测。结果显示，罗非鱼源无乳链球菌Ｈｎ０３０３ ＥＦ－Ｔｕ基因有１个由１１９７个碱基组成的ｏｒＦ，编码３９８个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为ｃ＿（１９３３）Ｈ＿（３０９６）ｎ＿（５３２）ｏ＿（６１５）Ｓ＿（１１），分子质量为４３．９８１ ｋｕ，理论等．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜琳 郝永清
为了解内蒙古地区隐性乳房炎无乳链球菌分离株耐药性及耐药基因，采集内蒙古不同地区的规模化养殖场隐性乳房炎乳样，采用Ｋｉｒｂｙ－ｂａｕｅｒ（Ｋ－ｂ）纸片扩散法测试分离株对１６种抗菌药物的敏感性，ＰＣｒ方法检测其耐药基因。结果显示：无乳链球菌对大部分抗生素较敏感。对其有较强抑菌作用的药物为：青霉素Ｇ、头孢噻肟、头孢唑啉、阿莫西林、红霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、林可霉素、呋喃妥因、万古霉素。其敏感性达到９０％～１００％。该菌株对四环素有较强的耐药性，耐药率达７７．２７％。ＰＣｒ扩增四环素耐药基因ｔｅｔＭ、ｔｅｔＯ、ｔｅｔＫ、ｔｅｔＬ，结果显示２２株无乳链球菌均含有ｔｅｔＭ基因，其基因的检出率为．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
张新艳 樊海平 钟全福 卓玉琛 林煜 曾占壮
从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA,将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验,试验感染罗非鱼表现出自然发病症状,确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌。分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16S rRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示,分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支,而海豚链球菌则构成另一分支,确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)。分离菌株对氨苄西林、...
[期刊] 水产学报
[作者]
祝璟琳 邹芝英 李大宇 肖炜 韩珏 杨弘
为了解尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后各组织的病理变化,运用革兰氏染色和电镜负染技术对一株从自然发病的尼罗罗非鱼上分离的无乳链球菌进行形态观察,采用组织切片和超薄切片电镜技术对患病尼罗罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑、心肌、骨骼肌、肠、鳃等8种组织进行病理学研究,探讨该病的致病机理。结果显示,革兰氏染色呈阳性,负染后透射电镜观察多数细菌呈链状排列;组织病理学变化主要是各内脏器官的广泛充血、水肿、变性和炎性细胞浸润,严重的细胞坏死;超微病理显示,大量球菌侵染脾脏等内脏组织,破坏细胞结构和各种细胞器;细胞界限模糊,细胞核畸形,线粒体肿大,嵴断裂,溶解;粗面内质网肿大、核糖体脱落;细胞质空泡化严重;心肌和骨骼...
关键词：
尼罗罗非鱼 无乳链球菌 病理学 超微结构
[期刊] 水产学报
[作者]
刘志刚 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英
为了解温度对鱼源无乳链球菌毒力的影响机制,本实验研究了温度对无乳链球菌毒力相关参数(生长、粘附、入侵、毒力基因表达以及对罗非鱼致死率)的影响。结果发现,不同培养温度下(25~40℃)无乳链球菌的生长速度不同,37℃为其最适生长温度,25℃时生长速度最慢;25~34℃内无乳链球菌粘附在惰性基质上的菌体对应的吸光值(OD590nm)之间无显著差异(P>0.05),37℃时显著增加,40℃时又急剧下降;罗非鱼在人工感染无乳链球菌后各时间点(6、12、24和48 h),鱼体脑组织中菌量随注射菌体培养温度的增加呈先上升后下降的趋势,且与不同培养温度下的无乳链球菌对罗非鱼的致死率呈正相关;无乳链球菌毒力基...
关键词：
尼罗罗非鱼 无乳链球菌 温度 毒力
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