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[期刊] 中国水产科学
[作者]
许文静 丁千千 高炜峰 敖士齐 朱玉洁 高晓建 张晓君 姜群
为了探究葡萄糖转运蛋白1 (glucose transporter type 1, GLUT1)在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)糖代谢调控中的作用,本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得罗氏沼虾Mr-GLUT1基因全长cDNA序列,该基因全长1929 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1446 bp,编码481个氨基酸,分子量为52035.73,等电点为6.76。多序列比对及系统进化树分析结果显示,十足目GLUT1基因具有较高同源性,均存在12个跨膜结构域,罗氏沼虾GLUT1与对虾首先聚为一支,表明亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,Mr-GLUT1在罗氏沼虾各组织均有表达,肠道表达量最高。葡萄糖注射后,罗氏沼虾血淋巴葡萄糖水平、肝糖原和肌糖原含量迅速升高,肠道、肝胰腺和肌肉组织Mr-GLUT1基因表达显著上调,但Mr-GLUT1基因表达变化时间延迟于葡萄糖含量的变化。RNA干扰沉默罗氏沼虾体内Mr-GLUT1基因表达后,血淋巴中葡萄糖和海藻糖含量显著上升。研究表明, Mr-GLUT1基因可能参与罗氏沼虾血糖稳态调节,在葡萄糖和海藻糖转运过程中发挥重要作用。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
王其梁 邱高峰
克隆了罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）含DM结构域的Dsx基因（MroDsx）部分序列，DM结构域包含5个保守的半胱氨酸（cysteine）和2个组氨酸（histidine）， 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis )Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）结果显示：MroDsx基因仅在性腺中特异性表达，且在精巢中的表达量显著高于卵巢；在精巢发育早期（主要是精原细胞）高表达，随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(in situ hybridization，ISH)结果进一步显示：MroDsx转录本在精原细胞表达量高，在精母细胞以及精细胞中较弱，在成熟的精子中不表达，与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析，暗示：MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。
关键词：
罗氏沼虾 Doublesex 性腺发育
[期刊] 水产学报
[作者]
姜群 高炜峰 许文静 纪鹏 顾舒文 张颖杰 高晓建 张晓君
为研究维甲酸类X受体 (RXR) 在甲壳动物蜕皮过程中的调控作用，实验采用RACE技术克隆获得罗氏沼虾Mr-RXR基因，通过qRT-PCR分析了Mr-RXR及其他蜕皮相关基因 (MIH、EcR、E75和CHIT) 在罗氏沼虾不同组织、不同蜕皮阶段的表达情况，并采用RNAi探究Mr-RXR对罗氏沼虾蜕皮相关基因表达的调控作用。结果显示，Mr-RXR基因cDNA全长2 241 bp (GenBank No: MZ501612)，包括36 bp的5′末端非翻译区 (UTR) 和719 bp的3′UTR，开放阅读框 (ORF) 为1 386 bp，共编码461个氨基酸。罗氏沼虾RXR氨基酸序列与甲壳动物同源性较高，存在保守的DNA结合域 (DBD) 和配体结合域 (LBD)。Mr-RXR在罗氏沼虾所有组织中均表达，精巢、眼柄、心脏等组织中表达量较高，其表达水平随蜕皮周期改变，眼柄和肌肉组织中均在蜕皮前期表达量最高，与EcR基因表达模式基本同步；E75和CHIT基因表达模式较为相似，眼柄和肌肉组织分别在蜕皮前期和蜕皮后期高表达；MIH基因仅在眼柄组织表达，且蜕皮间期表达量最高。采用3 μg dsRNA/g虾的剂量进行为期12 d的RNAi实验诱导Mr-RXR沉默，罗氏沼虾出现大量死亡，qRT-PCR显示，眼柄和肌肉中Mr-RXR干扰效率分别为79%和55%。眼柄组织中Mr-RXR基因沉默后，MIH基因表达未受影响，EcR、E75和CHIT基因表达水平显著降低，肌肉组织中，Mr-RXR沉默仅造成CHIT基因表达水平的显著下降，推测Mr-RXR可能通过影响EcR、E75和CHIT基因表达调控罗氏沼虾蜕皮过程。本研究结果将为甲壳动物蜕皮调控机制研究提供基础资料。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
雷彩霞 宋含茹 付豪 谢玉净 李胜杰
为进一步研究大口黑鲈(Micropterussalmoides)糖稳态调控特性,本研究克隆了糖稳态调控基因gp1、gp2、pepck1、pepck2、hk、pfk和g6p,分别编码878、842、635、624、918、780和338个氨基酸序列,并进行了进化树、空间分布和禁食对其基因表达影响的分析。多序列比对和进化树分析显示,这些基因与其他脊椎动物的同源序列具有较高相似性。组织表达分析结果显示这些基因主要集中分布于肝脏和肌肉,但呈现出组织表达差异性。其中,gp1在肌肉表达量最高,肝脏次之,在脾脏表达量最低。gp2在肌肉中的mRNA水平也最高,在心脏、肝脏表达也较为丰富。pepck1主要分布在肝脏和肠,在脑、脾脏、肾脏和脂肪中分布较少。pepck2在肝脏和脑中高表达,而在脾脏和鳃中表达量最低。对于hk,其在肝脏、肌肉和心脏的mRNA水平显著高于其余组织。肝脏中g6p的表达也显著高于其余组织。除此之外,其在肌肉、肠和脂肪中分布也较为丰富。pfk的mRNA水平在肝脏和心脏最高,其次是肠和鳃。对实验大口黑鲈禁食后发现,肝脏gp2、pepck2和g6p的表达从禁食第6小时开始上调并持续到24h。而gp1、hk和pfK的表达则随禁食延长先上升后下降,并在第6小时时达到峰值。然而,肝脏pepck1基因在整个禁食阶段均趋于稳定。肌肉组织中, gp1的转录随禁食延长而持续增强,至24 h达到最高值。gp2和g6p表达均在禁食第12小时出现明显升高,并在24 h达到峰值。pepck1在禁食第0小时的mRNA水平最低,在12和24 h时最高。禁食第24小时pepck2的表达显著最高。hk和pfk则随禁食延长呈现先升后降的模式,其最高和最低值分别出现在禁食第6和第0小时。综上,本研究获得了糖稳态调控关键基因的完整编码序列,并研究了其在应对饥饿状态时的不同分子应答,研究结果将为后期进一步研究大口黑鲈糖稳态调控提供重要基础资料。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨光 秦真东 赵丽娟 詹凡玢 沈海洋 张梦兰 卢志杰 叶成凯 李凤麟 潘淦 林蠡
蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1 859 bp,开放阅读框(ORF)为1 629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。
[期刊] 水产学报
[作者]
叶成凯 卢志杰 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
苏建 戴习林 刘红 刘伟利 高翔 刘洁 丁福江
提取罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)上海养殖群体活体鳃、肌肉、肝胰腺、血液和雄性腺5种组织的总RNA;应用RT-PCR技术,从鳃组织中克隆到Toll样受体(TLR)基因部分cDNA序列,并进行生物信息学分析。基因序列分析表明:所得罗氏沼虾TLR基因cDNA序列长1 875 bp,包含1 728 bp的开放阅读框,可编码575个氨基酸残基;该部分TLR是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRR-CT、LRR-NT结构域及关键的胞内区TIR结构域,具备Toll样受体家族的典型结构特征;TIR结构域与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Ma...
[期刊] 水产学报
[作者]
卢志杰 叶成凯 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏>肌肉>胃>肠>鳃>心脏>脑>血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑>鳃>胃>肠>肌肉>心脏>血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。
关键词：
罗氏沼虾 谷氨酰胺合成酶 组织表达 蜕壳
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李屹铮 张帅帅 刘雪巍 张冉 林鑫辉 张猛 王磊 于淼 乔志刚 江红霞
为了探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)核糖体蛋白S3a(MnRPS3a)在其卵巢发育中的功能，利用cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR技术获得了MnRPS3a基因的全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫荧光(IF)技术分别进行了该基因的表达模式和蛋白定位分析。结果显示，MnRPS3a基因cDNA全长902 bp,共编码266个氨基酸；MnRPS3a与墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RPS3a氨基酸序列相似性最高，进化上的亲缘关系也最近；在不同组织中，MnRPS3a基因在肌肉中的表达量最高；在不同发育阶段卵巢中，MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢中的表达量最高；注射5-羟色胺(5-HT)能诱导日本沼虾卵巢MnRPS3a和卵黄蛋白原(Vg)基因表达升高，而注射多巴胺(DA)则抑制这2个基因表达。MnRPS3a蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的滤泡细胞、Ⅲ期和Ⅳ期卵巢卵母细胞的细胞质中。结果表明MnRPS3a可能在日本沼虾卵巢发育调控中发挥重要的作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
江红霞 林鑫辉 李书凯 王洁琛 李学军
为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12～72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12～72 h和6～72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
刘问 钱冬 吴建翔 邵健忠
罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)的基础上,用MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶10...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵倩倩 孙西超 郑诚 薛程 孙盛明
为探究细胞凋亡相关基因Bax (B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用，实验采用cDNA末端快速扩增(RACE) PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡基因Bax基因cDNA全长序列，采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况，同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位。日本沼虾Bax基因cDNA全长2 287 bp (NCBI登录号：MZ823353)，包括5 '非编码区(UTR)为42 bp，3' UTR为814 bp，开放阅读框(ORF) 1 431 bp，编码476个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析，氨基酸相似度比对显示，日本沼虾细胞凋亡基因Bax富含高度保守的BH1、BH2及BH3结构域；系统进化树分析显示，日本沼虾Bax基因与斑节对虾等甲壳动物Bax聚类一支，具有最近的亲缘关系。RT-PCR结果表明，日本沼虾Bax基因在肝胰脏中表达最高，在脑中表达最低。在低氧胁迫1～96 h时，日本沼虾鳃和肝胰腺组织Bax基因表达量均显著高于对照组，这与日本沼虾Bax蛋白表达丰度基本相似。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白Bax，并将纯化重组蛋白免疫兔子获得抗血清。免疫组化结果显示，鳃和肝胰腺Bax蛋白阳性信号主要定位在鳃上皮细胞和肝细胞中。最后，采用流式细胞仪分析表明，日本沼虾血细胞凋亡率在低氧胁迫96 h时显著高于对照组，这与日本沼虾Bax基因转录水平和蛋白表达丰度相吻合。日本沼虾Bax基因在日本沼虾不同组织应答低氧胁迫分子过程中均具有促凋亡作用。为探明日本沼虾不耐低氧的分子机制提供理论参考。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王晓兰 贡成良 薛宇醒 曹广力 魏育红 陈辉 许雅香 张伟明 薛仁宇
根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
金舒博 王宁 乔慧 傅洪拓 吴滟 龚永生 蒋速飞 熊贻伟
本研究首次克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)高血糖激素(crustacean hyperglycemic homone,CHH)基因全长cDNA序列,并使用荧光定量PCR技术首次检测了CHH基因在青虾不同组织中的表达。青虾CHH基因cDNA全长1 017 bp,包括241 bp的5′UTR,408 bp的开放阅读框(ORF),355 bp的3′UTR,开放阅读框编码135个氨基酸。成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基。青虾CHH成熟肽C端为GK,确定为ES型CHH基因。蛋白相似度比对显示,所分离的青虾CHH被归为CHH家族I型肽。系统进化树分析表明,青虾C...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈昊 戴琴 干雅梅 高焕 阎斌伦 赖晓芳
为探究strawberry Notch1基因（SBNO1）在甲壳动物中的免疫功能，对脊尾白虾SBNO1的cDNA序列全长、系统进化、组织分布以及副溶血弧菌感染后SBNO1和Notch信号通路中相关基因表征进行了研究。结果显示，脊尾白虾SBNO1 cDNA序列全长4 353 bp，共编码1 380个氨基酸，预测相对分子量158.91 ku，理论等电点4.81。qPCR分析显示，脊尾白虾SBNO1在各组织中均有表达，其中在肝胰腺中表达量最高，性腺次之。利用RNAi干扰SBNO1显示，脊尾白虾在感染副溶血弧菌后，干扰组死亡率显著高于未干扰组。副溶血弧菌感染脊尾白虾后显著影响了Notch信号通路中SBNO1、Numb与Delta在肝胰腺中的转录情况，而Jagged表达差异不显著。SBNO1和Numb的表达量随时间变化都呈现出先上升后下降的趋势，Delta的表达量呈现出先下降后上升的趋势。研究表明，Notch信号通路参与了脊尾白虾副溶血弧菌感染后的免疫。本研究有助于阐明无脊椎动物先天免疫的机制，为抗病脊尾白虾的分子育种提供理论依据。
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