罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...

罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)和双顺反子病毒(M.rosenbergii dicistrovirus,MrDV)是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT-PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对...

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义。为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(W SSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测。检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8%;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5%;桃拉病毒检出率为3.1%;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒。该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数...

Taura综合征病毒(TSV)是世界动物卫生组织(OIE)目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的103倍,最低可检测到10fg的TSVRNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV特异性扩增片段435 bp,IHHNV特异性扩增片段301 bp和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0...

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...

【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．

为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus, LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RTPCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测。结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10~(-12) mol,最佳退火温度分别为64.1℃和61.5℃,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为10~2 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10 000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60%,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21%;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控。

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样...

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒—甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列，利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物；以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板，在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增，初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系；通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化，建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系，并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示，优化的多重RT-PCR体系，各病毒引物之间不会出现交叉干扰，所扩增的4条目的条带清晰，能够明确区分上述4种甘薯病毒；挑战检测和灵敏度测试显示，此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒，不仅准确灵敏，而且降低了检测成本，提高了病毒检测效率。

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus,AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus,CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus,CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus,PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus,MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104....

根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于I、Ⅱ、Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL。该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物。利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8. 2%,Ⅱ型阳性率为85. 7%,Ⅲ型阳性率为2%,I、Ⅱ型混合感染阳性率为4. 1%,其他类型的混合感染未检测到。结果表明,本研究建立的针对I、Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性。

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜...