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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
黄笑 王国浩 董宣 唐琼英 段虎 杨国梁 黄倢
细胞平台是研究病原–宿主互作的重要工具，目前缺少虾类细胞系，严重制约了虾类病毒学研究。传染性早熟病毒(IPV)是近年来发现的能够导致罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)性早熟和生长缓慢的一种新病毒，主要侵染罗氏沼虾神经组织。为建立罗氏沼虾病毒–宿主互作的体外研究平台，本研究采用木瓜蛋白酶消化健康罗氏沼虾的脑、眼柄、胸神经节和腹神经节，获取罗氏沼虾神经细胞，并利用L-15培养基进行离体培养。选择培养效果最佳的脑神经细胞进行IPV体外感染。结果显示，培养的原代细胞在含有谷氨酰胺的L-15培养基中生长良好，其中，从脑组织和眼柄X器官–窦腺复合体中分离出的细胞在体外存活时间可达15 d，从胸腹神经节中分离出来的细胞在体外存活时间达9 d。在本研究所采用的感染方式和剂量条件下，脑细胞在感染96 h后检测到高载量的IPV。本研究建立了一种操作简便的罗氏沼虾神经细胞原代培养技术，为罗氏沼虾神经内分泌研究和病毒–宿主互作提供了基础数据和平台。
[期刊] 水产学报
[作者]
张岩 段虎 金松君 李富花 相建海
本研究采用酶解的方法获得红螯螯虾眼柄ＸＯ－ＳＧ复合体的单个神经细胞，并依据显微观察对ＸＯ－ＳＧ神经细胞进行分类，同时利用ＬｅｉｂＯｖｉｔｚ＇Ｓ Ｌ－１５等作为基础培养基离体培养解离的神经细胞。目的是建立虾类ＸＯ－ＳＧ神经细胞的分类标准并确定合适的培养条件，便于在体内外开展神经内分泌系统的调控研究。结果显示，根据神经细胞形态特点，红螯螯虾ＸＯ－ＳＧ神经内分泌细胞分为６种类型，不同类型的细胞在细胞大小以及显微结构上存在明显差异；建立了红螯螯虾眼柄ＸＯ－ＳＧ神经元的体外原代培养方法，细胞在改良的Ｌ－１５培养基中存活状态良好，原代培养的神经细胞可以在体外存活１４ ｄ。离体培养过程中，不同类型神经细胞的．．．
关键词：
红螯螯虾 眼柄 原代培养 神经细胞 再生
[期刊] 淡水渔业
[作者]
宋增福 吴天星 潘晓东
探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
谢保胜 祁晓霞 史健全 祁洪芳
采用组织块移植培养技术,用RPMI 1640培养基对来源于青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)肾组织的细胞进行原代培养。结果显示:培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕;培养一周可形成单层细胞;对原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后,传代培养至第四代。实验初步确立青海湖裸鲤肾细胞培养条件为:培养基RPMI 1640,培养温度为27℃,pH值为7.0~7.5,原代培养血清浓度为20%,传代培养的血清浓度为10%,无需通入CO2。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘敏 潘敏慧 吴克军 鲁成
取家蚕4~5龄幼虫背部脂肪体,采用胰蛋白酶消化和组织块贴壁法进行离体培养,观察脂肪体细胞在体外培养过程中的变化。结果表明,家蚕脂肪体细胞在原代培养过程中出现了一批具有各种形态的脂肪前体细胞,细胞间呈管道状或网状排列等,可在体外培养条件下繁殖。最后这些细胞充满油滴后陆续死亡。该观察结果可为进一步探讨家蚕脂肪体细胞的分化及脂类代谢调节机制提供实验条件。
关键词：
家蚕 脂肪体细胞 原代培养
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵倩明 左晓昕 詹康 隋雁南 封飞飞 赵国琦
为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁
[期刊] 华北农学报
[作者]
贾睿 曹丽萍 丁炜东 杜金梁 徐跑 殷国俊
通过不同的分离方法和培养条件探索鲫鱼肝细胞的原代培养,以建立稳定的鲫鱼肝细胞原代培养模型。用台盼蓝染色检测细胞存活率;用WST-1检测细胞活力,同时观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果显示:组织块培养4～5 d后肝细胞从组织块中迁出并增殖,但这种方法所需时间长且细胞不易收集;机械分散法收集的细胞少,细胞存活率低;而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离和培养效果。用0.1%胰蛋白酶消化30 min,每克肝重可收集1.47×108个细胞,平均存活率为91.43%。培养基和血清浓度均会影响肝细胞的贴壁和生长。在含有10%(V/V)胎牛血清(FCS)M199培养基中,4%CO2、28℃,肝细胞培养8～...
关键词：
鲫鱼 肝细胞 胰蛋白酶 原代培养
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
喻文娟 杨先乐 唐俊 郑宗林 张宁
取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。
关键词：
大口黑鲈 肝细胞 原代培养
[期刊] 水产学报
[作者]
国子娟 王印庚 荣小军 廖梅杰 郭华荣 韩倩
为深入了解对虾白斑综合征病毒(WSSV)的致病机理和体外培养的对虾细胞对WSSV的敏感性,实验以1.5×L-15培养基培养刀额新对虾原代淋巴细胞,待细胞形成单层后接种WSSV,通过倒置显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察接种病毒后细胞的病理变化。结果显示,使用1.5×L-15培养基培养对虾淋巴组织,3 h后可观察到有细胞迁出,并能迅速形成单层,36 h后细胞的迁出汇合率可达80%,且能存活20 d以上。接种WSSV 24 h后,出现病变的细胞变圆、漂浮,细胞之间的网状结构消失,最后细胞破碎、溶解;接种WSSV 48 h后Hoechst 33342染色结果显示,感染的细胞核深染,且变形、膨大;...
[期刊] 水产学报
[作者]
骆源 张春晓 王玲 张冬玲 霍振华 宋凯
本研究以斜带石斑鱼肝细胞为实验对象，在不同培养条件下进行原代培养，旨在探讨稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法。采用组织块分离法和胰蛋白酶（含ＥＤＴＡ）消化法分离肝细胞，并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞，细胞悬液于ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｍ１９９和Ｌ－１５培养液中培养；细胞活力及数量采用血球计数板计数，并通过ＭＴＴ法测定细胞增殖率；同时，测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性、白蛋白（ＡＬＢ）和尿素氮（ＢＵＮ）的含量，以分析肝细胞生长状态。结果表明，组织块方法不适于斜带石斑鱼肝细胞的培养，未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果，细胞产量达到１．６×１０８．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
姚仕彬 叶元土 蔡春芳 姚林杰 许凡 刘猛 萧培珍 王丽宏
以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...
关键词：
草鱼 肠道粘膜细胞 分离方法 原代培养
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
向华 张彦明 程媛媛 康恺 杨幼聪
【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈明勇 陈德威 高齐瑜 张冰
研究了传染性法氏囊病病毒 (IBDV)变异 E株人工感染体外培养法氏囊细胞的凋亡。电镜观察和DNA电泳分析表明 ,IBDV感染后 4～ 2 4 h,法氏囊培养细胞呈现典型细胞凋亡的形态学特征和生化特征。经流式细胞计检测、荧光染色观察和统计学分析表明 ,IBDV感染后 4～ 2 4 h,法氏囊培养细胞凋亡数量显著增加 (P
[期刊] 水产学报
[作者]
刘问 钱冬 吴建翔 邵健忠
罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)的基础上,用MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶10...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
童桂香 黎小正 卢小花 廖永志 江林源 韦信贤
罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...
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