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[期刊] 水产学报
[作者]
叶成凯 卢志杰 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨光 秦真东 赵丽娟 詹凡玢 沈海洋 张梦兰 卢志杰 叶成凯 李凤麟 潘淦 林蠡
蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1 859 bp,开放阅读框(ORF)为1 629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。
[期刊] 水产学报
[作者]
王佩 郭爱莲 张宇 吕艳杰 宁黔冀
为了解日本沼虾几丁质合成酶(Chs)基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因(Mn Chs)c DNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT-PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其c DNA全长5 133bp,5'UTR为283 bp,3'UTR为159 bp,开放阅读框(ORF)长度为4 701 bp,编码1 566个氨基酸,分子量为179.57 ku,理论等电点为6.09,包含2个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89%和...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姚琴琴 杨志刚 王瑶 郭子好 刘启彬 施秋燕 成永旭
采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和Ｃ ＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）技术，依据锯缘青蟹（ＳＣｙｌｌＡ ＳＥＲＲＡＴＡ）几丁质酶基因的保守区设计引物，克隆了中华绒螯蟹（ＥＲｉｏＣｈＥｉＲ ＳｉＮＥＮＳｉＳ）几丁质酶基因（ｈＸＣｈｉＴ）全长，并通过荧光定量ＰＣＲ（ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）技术研究了ｈＸＣｈｉＴ在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示，ｈＸＣｈｉＴ基因Ｃ ＤＮＡ全长２ ０４２ ｂＰ（ＧＥＮ ｂＡＮｋ ＡＣＣＥＳＳｉｏＮ Ｎｏ．ｋＪ５１３４６６），包括５′非编码区（５′ＵＴＲ）３５ ｂＰ，３′非编码区（３′ＵＴＲ）５３７ ｂＰ，开放阅读框（ｏＲＦ．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
王伟 吴旭干 潘桂平 侯文杰 成永旭
为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用,本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因(Pt Chi)c DNA全长(登录号:KF914663),并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明:(1)Pt Chi基因c DNA全长2 200 bp,包括5'非编码区(5'-UTR)16 bp、3'非编码区(3'-UTR)714 bp和开放阅读框1 470 bp,编码489个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点为53.97 ku和4.76。(2)Blast P结果显示,Pt Chi推导氨基酸序列与已知甲壳动物Ch...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姚琴琴 杨志刚 王瑶 郭子好 刘启彬 施秋燕 成永旭
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,依据锯缘青蟹(Scylla serrata)几丁质酶基因的保守区设计引物,克隆了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶基因(HXchit)全长,并通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究了HXchit在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示,HXchit基因c DNA全长2 042 bp(Gen Bank accession no.KJ513466),包括5′非编码区(5′UTR)35 bp,3′非编码区(3′UTR)537 bp,开放阅读框(ORF...
[期刊] 林业科学
[作者]
谢树章 秦平伟 张迷 胡雨晴 李名扬 眭顺照
在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...
关键词：
几丁质酶 克隆 原核表达 蜡梅
[期刊] 水产学报
[作者]
姜群 高炜峰 许文静 纪鹏 顾舒文 张颖杰 高晓建 张晓君
为研究维甲酸类X受体 (RXR) 在甲壳动物蜕皮过程中的调控作用，实验采用RACE技术克隆获得罗氏沼虾Mr-RXR基因，通过qRT-PCR分析了Mr-RXR及其他蜕皮相关基因 (MIH、EcR、E75和CHIT) 在罗氏沼虾不同组织、不同蜕皮阶段的表达情况，并采用RNAi探究Mr-RXR对罗氏沼虾蜕皮相关基因表达的调控作用。结果显示，Mr-RXR基因cDNA全长2 241 bp (GenBank No: MZ501612)，包括36 bp的5′末端非翻译区 (UTR) 和719 bp的3′UTR，开放阅读框 (ORF) 为1 386 bp，共编码461个氨基酸。罗氏沼虾RXR氨基酸序列与甲壳动物同源性较高，存在保守的DNA结合域 (DBD) 和配体结合域 (LBD)。Mr-RXR在罗氏沼虾所有组织中均表达，精巢、眼柄、心脏等组织中表达量较高，其表达水平随蜕皮周期改变，眼柄和肌肉组织中均在蜕皮前期表达量最高，与EcR基因表达模式基本同步；E75和CHIT基因表达模式较为相似，眼柄和肌肉组织分别在蜕皮前期和蜕皮后期高表达；MIH基因仅在眼柄组织表达，且蜕皮间期表达量最高。采用3 μg dsRNA/g虾的剂量进行为期12 d的RNAi实验诱导Mr-RXR沉默，罗氏沼虾出现大量死亡，qRT-PCR显示，眼柄和肌肉中Mr-RXR干扰效率分别为79%和55%。眼柄组织中Mr-RXR基因沉默后，MIH基因表达未受影响，EcR、E75和CHIT基因表达水平显著降低，肌肉组织中，Mr-RXR沉默仅造成CHIT基因表达水平的显著下降，推测Mr-RXR可能通过影响EcR、E75和CHIT基因表达调控罗氏沼虾蜕皮过程。本研究结果将为甲壳动物蜕皮调控机制研究提供基础资料。
[期刊] 水产学报
[作者]
卢志杰 叶成凯 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏>肌肉>胃>肠>鳃>心脏>脑>血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑>鳃>胃>肠>肌肉>心脏>血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。
关键词：
罗氏沼虾 谷氨酰胺合成酶 组织表达 蜕壳
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张凤 吕建建 刘萍 高保全 李健
为初步研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3的生物学功能,利用特异性引物扩增和SMART(TM) RACE技术克隆获得三疣梭子蟹PtCht3基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,三疣梭子蟹PtCht3基因全长为1409 bp,对PtCht3基因序列推导出的氨基酸序列进行分析可知,该基因编码由394个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为43.67 kDa,理论等电点为4.80。PtCht3蛋白亲水性总平均数为-0.097,属于稳定蛋白。同源性和系统
[期刊] 水产学报
[作者]
谢熙 朱冬发 崔晓雨 汤洁 邱锡尔
为了研究法尼酸甲基转移酶(FAMeT)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到了三疣梭子蟹FAMeT的全长cDNA序列(GenBank登录号:KC192659),它包括一个201 bp的5'非编码区、一个318 bp的3'非编码区和一个825 bp的开放阅读框(ORF),编码274个氨基酸;推导的氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物FAMeT进行比对,发现一致性达75%～97%,其中与远海梭子蟹FAMeT的一致性最高;而且该氨基酸序列由两个CF(CPAMD8/FAMeT)区域组成,这两个CF区域是FAMeT的标志,在所有甲壳动物的F...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
林晓红 潘鹤立 潘东明
【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是...
关键词：
中国水仙 几丁质酶基因 序列分析 抗病性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
危蓉萍 杨东航 卜莹莹 纪燕玲 于汉寿
［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱慧 王云霞 胡白石 刘凤权
利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质。生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。因此该蛋白具有一定的生物防治作用。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
王其梁 邱高峰
克隆了罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）含DM结构域的Dsx基因（MroDsx）部分序列，DM结构域包含5个保守的半胱氨酸（cysteine）和2个组氨酸（histidine）， 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis )Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）结果显示：MroDsx基因仅在性腺中特异性表达，且在精巢中的表达量显著高于卵巢；在精巢发育早期（主要是精原细胞）高表达，随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(in situ hybridization，ISH)结果进一步显示：MroDsx转录本在精原细胞表达量高，在精母细胞以及精细胞中较弱，在成熟的精子中不表达，与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析，暗示：MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。
关键词：
罗氏沼虾 Doublesex 性腺发育
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