2018年和2019年，山东省烟台市蓬莱市一养殖场工厂化养殖的绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)和许氏平鲉(Sebastes schlegeli)发病死亡，主要症状为嘴部溃疡、红肿和出血。从发病鱼内脏中均可分离到大量形态一致的优势菌，分别命名为2018TS-1和2019SS-1，分离菌株经16S rRNA测序、生理生化鉴定和vapA基因分析确定为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. masoucida)。人工感染实验证明，2018TS-1和2019SS-1分别能引起绿鳍马面鲀和许氏平鲉的死亡，被感染鱼呈嘴部红肿症状，与自然发病症状一致，其半数致死量分别为1.78×10~(5)和0.89×10~(5) CFU/尾。本研究首次报道了国内工厂化养殖绿鳍马面鲀和许氏平鲉感染杀鲑气单胞菌的病例，是目前人工养殖绿鳍马面鲀的首个疾病报道，也是继大西洋鲑(Salmo salar)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)等品种后，在山东省海水养殖鱼类中再次发现杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染，本研究结果丰富了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染宿主范围，也为绿鳍马面鲀和许氏平鲉养殖过程中病害防控提供了依据。

从皮肤溃烂的大西洋鲑(Salmon salar)肌肉、肝、肾分离到一致病性的菌株(AB080226),经人工感染实验证实其为该病的病原菌,研究了该菌的形态、生理生化特征并对其16SrDNA序列进行了在线Classifer和Blast分析。结果显示:该菌为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长;能利用甘露醇,不具运动性,能发酵麦芽糖,葡萄糖产酸阳性,精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶阴性;该菌属于气单胞菌属的细菌,在系统发育树上与杀鲑气单胞菌形成一个簇群,同源性高达99.9%以上。综合形态学、生理生化特征及16SrDNA序列鉴定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas ...

从患病细鳞鱼(Brachymystax lenok)的病变组织处分离到1株致病菌,经过分离培养,生化鉴定,16 S rRNA序列分析和人工感染实验确定该病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。采用20种药物进行药敏分析,结果显示:分离菌株对阿米卡星、哌拉西林、恩诺沙星等9种抗生素敏感;对环丙沙星、诺氟沙星等4种抗生素中度敏感;对卡那霉素、青霉素、氨苄西林等7种抗生素耐药。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是广受我国消费者认可的名优鱼类,具有很高的营养价值和经济价值,然而,随着工厂化养殖模式的不断发展,疾病成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素,其中,体表溃疡病为其常见病症。从严重溃疡病半滑舌鳎体内分离到1株优势菌株HX0416,该菌可在TCBS培养基上生长,并可在绵羊血平板上形成清晰的β-溶血环;经过16S rRNA和rpo D基因序列同源性分析并结合生化特性鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。健康半滑

从患病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肝脏中分离得1株优势菌DF-1。将菌DF-1进行人工回感试验,其患病症状同自然发病症状,证明其对鲫有致病性。该菌的形态特征、主要理化特性、16S rRNA序列测定结果及系统发育树的构建均表明其为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。药敏试验结果表明,该菌对甲哌利福霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、阿洛西林、氟苯尼考等12种药物敏感,对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、罗红霉素、克林霉素等15种药物表现出耐药性。

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌，可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种，目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测，针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp. masoucida)，本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息，选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因，根据其序列设计特异性引物，进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化，并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示，2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测，均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA)，对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验，感染后取病鱼组织进行PCR检测，结果显示，本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述，本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法，该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异,本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28°C和4°C下的生长及三甲胺(TMA)、生物胺和挥发性盐基氮(TVB-N)的生成;通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因(torA),利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示,杀鲑气单胞菌在28°C生长较快,而波罗的海希瓦氏菌在4°C生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺,波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺,在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因,2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%,而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52,甘氨酸含量最高,而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74,丙氨酸含量最高,蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA和鸟氨酸脱羧酶(DOC)基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见,波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌,其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强,与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。

为研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异，分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28°C和4°C下的生长情况，三甲胺（TMA）、生物胺的生成及挥发性盐基氮（TVB-N）的积累。PCR扩增2种腐败菌的氧化三甲胺（TMAO）还原酶基因（torA），生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。在28°C培养下，杀鲑气单胞菌生长较快，而波罗的海希瓦氏菌在4°C下生长更快。相对于杀鲑气单胞菌，波罗的海希瓦氏菌产生更多的TMA和腐胺，在冷藏鱼汁中积累更高的TVB-N，表明波罗的海希瓦氏菌具有强胺类生成能力。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2490和1959 bp的torA基因。生物信息学分析显示，2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%，而二者间的相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌中TorA蛋白的分子量和等电点约为92.3 ku和6.52，甘氨酸含量最高，而气单胞菌中约为90.6 ku和6.74，丙氨酸含量最高，TorA蛋白结构差异明显，且波罗的海希瓦氏菌中蛋白表达量更高。波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌，其中波罗的海希瓦氏菌胺类代谢能力更强，与其TorA酶的高表达量及特定理化和结构密切相关。本研究为揭示海产品嗜冷腐败菌的致腐机制提供理论支持。

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。

为了研究几丁质酶对硅藻杀灭作用,以杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和其几丁质酶敲除菌为研究对象对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)进行共培养并探究其作用差异。结果表明:杀鲑气单胞菌野生株和缺失株分别与牟氏角毛藻共培养48 h后,野生株对牟氏角毛藻的杀藻率达到9.18%,而缺失株无明显杀藻活性;通过扫描电镜进一步发现野生株细菌能够裂解牟氏角毛藻的细胞壁,而缺失株不能。结果证实杀鲑气单胞菌因具有几丁质酶而对藻类具有杀灭作用。

从患病许氏平鲉的病灶处分离得到一株优势菌,记为SS-1。通过两点背部肌肉注射进行人工感染实验,证明该菌对健康许氏平鲉的半数致死浓度为9.6×106CFU/mL,可感染许氏平鲉的多种内脏和组织。细菌形态学和生理生化特征测定结果显示,菌株SS-1为革兰氏阴性,短杆状,极生单鞭毛;氧化酶阳性、接触酶阳性、硝酸盐还原阳性、吲哚产生阳性、V-P试验阳性、精氨酸双水解酶阳性、H2S产生阴性等,与鳗利斯顿氏菌特征相符。16S rRNA基因序列分析结果表明,该菌与鳗利斯顿氏菌的同源性达到了99%,因此,将菌株SS-1鉴定为鳗利斯顿氏菌。

为探讨利用鱼类行为及血细胞数量变化预警杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)病害发生的可行性,监测了生产中感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑(Salmo salar L.)的游泳行为,以及杀鲑气单胞菌攻毒后大西洋鲑血细胞数量的变化。实验采用同一养殖基地和同一批次的大西洋鲑,其中现场实验鱼选自生产车间健康的和感染杀鲑气单胞菌的养殖鱼,攻毒实验中处理组实验鱼每尾背肌注射100μL、浓度为3.05×107CFU/m L的菌液,对照组注射等体积灭菌生理盐水。现场实验表明,感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑临界游泳速度较健康鱼低26.7%(P<0.05),摆尾频率与游泳速度的线性回归方程的斜率也存在...

从许氏平鲉粘液、背鳍、鳃等部位分离筛选到同一菌株FZ09,经形态学观察、生理生化特性及热激蛋白65(HSP65)基因序列分析,鉴定菌株FZ09为海分枝杆菌。分别用酚-氯仿-甲醇法、乙醇-酚水法和传统热酚水法提取菌株FZ09的脂多糖(LPS),分析了LPS的组成和抗原性差异。SDS-PAGE结果表明,3种方法提取的LPS条带分布基本相同,主要条带分子量分别为14、16和23 ku,其中以乙醇-酚水法提取的LPS含量和纯度最高,热酚水法提取的LPS条带最多,抗原性最好。Western-blotting显示,海分枝杆菌抗血清主要与LPS的14 ku条带发生特异性免疫反应。高碘酸氧化免疫印迹结果表明,...

为确定患病翘嘴鲌的病原，本实验从患病鱼肝脏中分离到1株优势菌株CQ200825，对该菌进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA和gyrB基因序列分析、人工感染实验、毒力基因检测、组织病理观察以及药敏试验。结果显示，菌株CQ200825为短杆状的革兰氏阴性菌，通过16S rRNA和gyrB基因序列比对、系统进化树的构建、生理生化特性确认为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。人工感染实验组与自然发病鱼都表现为鳍条基部出血、肝脾肿大、有腹水等症状，同时从人工感染濒死鱼体内分离到与菌株CQ200825理化及分子特性一致的优势菌株，表明CQ200825为患病翘嘴鲌的病原菌，并计算出菌株CQ200825对翘嘴鲌的半数致死量为2.7×10~(6) CFU/mL。毒力基因检测结果显示，菌株CQ200825携带外膜蛋白(ompA)、溶血素(hlyA)、热稳定性肠毒素(ast)和细胞毒性肠毒素(act) 4种毒力基因。组织病理观察发现，患病翘嘴鲌的肝、脾、肾和肠均有不同程度的病变，即肝细胞肿胀、坏死、血管中血细胞凝集，脾脏红白髓界限不清、胞核有轻微肿胀，肾小管上皮细胞发生颗粒变性，肠绒毛大部分坏死脱落。药敏试验结果表明，菌株CQ200825对多西环素等17种抗菌药物高度敏感，对复方新诺明等4种抗菌药物中度敏感，对阿莫西林等12种抗菌药物表现为耐药。本研究可为翘嘴鲌维氏气单胞菌病的诊断与防治提供参考依据。

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参...