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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘丽华 沈卫德
将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。
关键词：
绿色荧光蛋白 秋黏虫细胞 基因表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
芮荣 邱妍 胡元亮 范必勤
以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的载体 ,对处于快速增殖期的 8株猪胚胎生殖 (EG)细胞 (4～ 9代 )进行转基因试验。用 1μgDNA和 2 μLLipofecTamine 2 0 0 0转染EG细胞后 ,共获得 4株转染EGFP基因的EG细胞系 (EG EGFP) ,可发出强绿色荧光 ;EG EGFP细胞连续培养 2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中 ,共注射 135枚胚胎 ,其中 112枚存活并发育至囊胚 (83 0 % ) ;86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞 ,其中 5 7枚囊胚在内细胞团 (ICM)上发现有E...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘洋 沙珍霞 陈松林 隋少飞 徐美瑜
通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为嵌合性表达。利用PCR技术,从花鲈尾芽期胚胎DNA中扩增出了特异片段,大小为750bp,表明显微注射胚胎中整合了外源GFP基因。
关键词：
GFP 花鲈 显微注射 转基因
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙莹 李俊平 黄小洁 李岭 曹明慧 李启红 李慧姣 杨承槐
【目的】鸭肠炎病毒（ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｖ）不同毒株间存在明显差异，ｄｅｖ疫苗株的ｕＬ２基因在１９５ｂｐ后连续缺失５２８ｂｐ，导致第６５位氨基酸后连续缺失１７６ａａ～（［１］）。将绿色荧光蛋白（ＧＦｐ）基因插入ｄｅｖ ｕＬ２基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究ｕＬ２基因对ｄｅｖ生物特性的影响和探讨ｄｅｖ作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的ｄｅｖ细胞适应株ｄｎａ为模板，利用ｐｃｒ技术扩增出病毒ｕＬ２基因上下游序列并克隆入ｐＭｄ－１８ｔ载体；以ｕＬ２基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将ｃＭｖ启动子控制的含有ＧＦｐ－Ｇｐｔ基因表达盒克隆入ｄｅｖ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵轶君 董浩 潘红艳 徐芳 赵佳 步怀宇 李红民
为开发以绿色荧光蛋白(GFP)为基因的原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,通过PCR扩增获得GFP编码基因,经限制性核酸内切酶消化后将GFP定向克隆至原核表达载体pMAL-c2X中malE基因下游的EcoRⅠ与HindⅢ位点之间,与malE基因融合为一个表达框。重组产物转化E.coli TB1感受态细胞,在添加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上于37℃培养12～16 h后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h,365 nmUV照射下挑取转化克隆,经扩大培养后用IPTG诱导GFP的表达并用SDS-PAGE检测表达效率。结果表明,融合在麦芽糖结合蛋白下...
[期刊] 水产学报
[作者]
苏建明 章怀云 肖调义 张学文 陈韬 苏建通 王跃智
通过体外重组,将绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到鲤鱼肌动蛋白基因启动子下游,构建成能在鱼体内表达绿色荧光蛋白的重组分子。用限制性内切酶PvuI酶切线性化后,通过显微注射法导入金鱼受精卵内,在转化后48h,可观察到绿色荧光,经PCR初步筛选后,对显阳性个体进行Southern杂交检测,结果表明,转化个体表现出较强的杂交信号。这说明绿色荧光蛋白基因能在金鱼体内整合、表达。
关键词：
绿色荧光蛋白 基因重组 金鱼 表达
[期刊] 林业科学
[作者]
李思蒙 王永林 黄冬辉 田呈明
以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得到108·mL-1的原生质体;在PEG介导下,通过含有潮霉素浓度为300μg·mL-1的PDA选择培养基筛选转化子,每微克DNA获得41个转化子的平均转化效率。对转化子进行PCR鉴定表明:hph基因和GFP基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中,通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清晰的绿色荧光,且转化子的潮霉素抗性和GFP表...
[期刊] 水产学报
[作者]
夏立群 梁海鹰 张红莲 秦启伟
新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP4...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵彤 黄丛林 张秀海 于荣 王永勤 吴忠义
Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因。构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首先从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt II和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt II/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB。通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵彤 于荣 黄丛林 王永勤 张秀海 吴忠义
【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段。然后将耐旱相关基因酵母海藻糖合酶基因tps1与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn、烟草叶绿体基因psbA的终止子构建表达盒(Prrn-tps1-TpsbA-ter),连同草丁膦抗性基因bar表达盒、卡那霉素抗性基因nptII和绿色荧光蛋白基因gfp构建的融和基因表达盒一起克隆到定点整合同源片段之间,构建高羊茅叶绿体的稳定表达载体gTKGB。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳永莉 于海泉
小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白（ＦＡＢＰ４）的启动子／增强子元件是脂肪组织特异性启动元件，为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果，首先以小鼠肝脏ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ克隆得到５．９ ｋＢ的ＦＡＢＰ４基因启动子片段，连入Ｐ ＭＤ１９－Ｔ载体后进行酶切及测序鉴定，经ＥＣｏ Ｔ ２２Ｉ酶切去除非核心启动子区后精简为２．３ ｋＢ的片段，通过ＳＡＣⅡ酶切将５．９ ｋＢ片段和２．３ ｋＢ片段的启动子连入红色荧光蛋白载体Ｐ ＤＳ－ＲＥＤ ２－１的多克隆位点，构建为表达质粒Ｐ ＭＦ５．９－ＲＥＤ和Ｐ ＭＦ２．３－ＲＥＤ，利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞，２４ ｈ后实时定量ＰＣＲ检测．．．
关键词：
小鼠FABP4启动子 载体构建 牛体细胞
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘芳 梁运祥
以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因(gfp)序列,扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)整合载体pAXc,构建重组质粒pAXc-gfp.pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411,gfp编码序列通过同源重组整合到B.subtilis B411染色体上,获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412.
关键词：
绿色荧光蛋白 枯草芽胞杆菌 基因标记
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
孙晓红 姚泉洪 陈明杰 潘迎捷
分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶Hind...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
龙华 尾里建二郎 若松佑子 松岛良次
以青 (Oryziaslatipes)为实验动物 (基因型bR ,体色红橙色 ,体长 2～ 3cm) ,以载体 pBluescriptSK +为原始质粒。构建含有青延伸因子 lα A(EF lα A )基因启动子和红色荧光蛋白 (RFP)基因的表达载体。用限制性内切酶Alw 4 4Ⅰ酶切上述载体质粒 ,显微注射实验证实 ,线状DNA比环状DNA在转基因青受精卵和鱼苗中更易表达。立体荧光显微镜检测结果表明 ,RFP基因的表达率和转基因鱼苗的存活率均较高 ,与绿色荧光蛋白 (GFP)基因一样 ,红色荧光蛋白 (RFP)基因也是一种理想的报告基因
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张小飞 李晓 崔丽娜 邹成佳 彭云良 杨晓蓉
本研究采用农杆菌介导法(ATMT)将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)获得了表达gfp的转化子。结果表明,转化子经过5代培养仍能发出稳定的荧光,转化后的菌落形态与菌丝生长速度差异不明显,对寄主仍有致病能力。通过PCR验证也表明gfp基因已成功转入到菌株PX1015基因组中,轮枝镰孢菌绿色荧光蛋白基因转化体的成功构建为该病菌侵染机制的研究奠定了基础。
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