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[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 柏立新
【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶(ALTre-1)基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体(pET28a-ALTre-1),表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg·mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 赵静 柏立新
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进...
关键词：
绿盲蝽 超气门蛋白 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
秦加敏 罗术东 廖秀丽 黄家兴 和绍禹 吴杰
【目的】克隆小峰熊蜂(Bombus hypocrita)可溶型海藻糖酶基因(soluble trehalase,Tre-1)全长c DNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂(B.terrestris)和B.impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘晓健 孙亚文 崔淼 马恩波 张建珍
【目的】海藻糖酶（ｔｒｅｈａｌａｓｅ）可专一性地将一分子海藻糖水解成为两分子葡萄糖，在昆虫能量代谢和几丁质合成过程中发挥重要作用，因此，海藻糖酶已成为害虫控制的潜在靶标。本研究以重要农业害虫飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）为材料，探讨海藻糖酶基因的分子特性及生理功能，为飞蝗的有效治理提供理论依据。【方法】通过搜索飞蝗转录组和基因组数据库，获得４个海藻糖酶基因ｃＤＮａ全长序列，运用ｂｌａｓｔ、ｔｍｈｍｍ和ｓｉｇＮａｌＰ等相关软件分析其序列特征；利用ｃｌｕｓｔａｌＷ进行海藻糖酶全长氨基酸序列比对，ｍｅｇａ７构建海藻糖酶的系统进化树；运用ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａＮｓｃｒｉＰｔｉｏＮ－ｑｕａ．．．
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
屈亚平 张智俊 王超莉 王蕾 吴林军
毛竹Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｅｄｕｌｉｓ阿拉伯糖－５－磷酸异构酶（Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ）是２－酮－３－脱氧辛糖酸（Ｋｄｏ）生物合成途径的第１个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）克隆得到毛竹Ｋｄｓ ｄ基因。该基因ｃ ｄＮａ全长１ ０３８ ｂＰ，编码３４６个氨基酸；对不同物种来源的Ｋｄｓ ｄ氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明：毛竹的Ｋｄｓ ｄ与玉米Ｚｅａ ｍａｙｓ等植物来源的Ｋｄｓ ｄ有很高的序列一致性，而与微生物来源的Ｋｄｓ ｄ序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）结果表明：Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
朱泾 赵述淼 彭楠 梁运祥
利用PCR技术从冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)REY15A中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(S.islandicus eng),将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至S.islandicus E233S(△pyrEF△lacS)。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)柱纯化,得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明:不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG-W)分子质量为41ku,带有信号肽的分子质量(ENG-SP)为43...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 草业科学
[作者]
刁桂萍 杨帅 遇文婧
从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘慧娟 郭晓军 郭妍妍 朱宝成
为进一步探讨全长基因和成熟肽基因的关系,根据已发表的假蕈状芽孢杆菌34 kDa纤溶酶全长基因DNA序列(GenBank FJ463037)和纤溶酶活性位点的位置,设计合成一对引物,扩增得到纤溶酶成熟肽基因G(951 bp编码317个氨基酸),连接pET-28a构建pET-28a-G载体,热激转化大肠杆菌BL21,成功获得pET-28a-G/BL21工程菌。终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测表达在胞内的融合蛋白,融合蛋白表观分子量约为40 kDa,符合所预测的结果。诱导菌体超声破壁后用纤维蛋白平板法检测表达产物具有纤溶酶活性,镍柱亲和层析纯化后的目的产物仍保留纤溶...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
文征宇 侯文韬 杨龙雨 陈鹏
【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表...
关键词：
牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
哲名家 张淼涛 云涛 王玢瑸 刘光清
【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45ku;表达的重组...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
潘冬 张玉磊 同拉嘎 李明月 李丹 韩云飞 王海微 张忠臣 金正勋
【目的】分析不同"库"容量对水稻灌浆后期叶、茎、鞘中可溶性总糖含量及剑叶蔗糖代谢相关酶活性、Rubisco和谷氨酰胺合成酶同工型基因转录表达量的影响。【方法】选用寒地粳稻穗重型超级稻品种‘松粳9号’和穗数型高产品种‘龙稻11号’作为供试材料进行盆栽试验。在灌浆期分别进行不同剪穗处理,分别是无穗、半穗和全穗处理。【结果】表明,在同等的"源"条件下减小"库"容量有利于提高籽粒的粒重和成熟度,随着"库"容量的增加所需的灌浆时间就越长;没有"库"容时光合产物主要贮藏在叶、茎、鞘等营养器官中,但有"库"容时主要转移
[期刊] 林业科学研究
[作者]
宋传生 胡佳续 林彩丽 任争光 耿显胜 田国忠
胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孟星宇 李婷 李沐 刘宁 田玉华 胡薇
【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
唐斌 沈祺达 曾伯平 肖仲久 邱玲玉 潘碧莹 李昆 张道伟
【背景】昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因。前期研究发现褐飞虱(Nilaparvata lugens)中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。【目的】通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。【方法】对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长c DNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰(RNAi)技术抑制TPS3的表达。【结果】在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,ds TPS3能有效抑制TPS3的表达。【结论】在褐飞虱中发现一个新的TPS(TPS3),其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。
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