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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
安静 张雪梅 刘晨曦 刘明军
【目的】克隆绵羊IGF-1基因CDS区,构建绵羊IGF-1基因慢病毒表达载体,分析IGF-1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA,通过RT-PCR方法获得IGF-1全长CDS序列,经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接,构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒,并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞,并用重组慢病毒使其感染,建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线,分析过表达IGF-1对绵羊成肌细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518bp的IGF-1CDS区序列。成功构建...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘晨曦 唐森 李文蓉 刘明军
【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】克隆的新疆细毛羊MSTN基因...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
覃鸿妮 谢钰珍 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘超 于萌 朱海鲸 李明昭 华进联
【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱贵明 陈宏 高强 陈红星 邓继先
为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
汤展毅 严云勤 高学军 陆黎敏 朱丹丹 冀志庚
【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P<0.01),肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高(P<0.01)。细胞...
关键词：
牛myf6 稳定转染 成肌细胞
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄凯 林亚秋 朱江江 马洁琼 王永
【目的】为利用超表达手段进一步研究成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的影响。【方法】本试验通过构建p Ad Track-CMV-FGF1穿梭质粒,转入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得腺病毒超表达载体pAdEasy-FGF1,经Pac I酶切鉴定后转染293A细胞进行病毒的包装与扩繁,最后用包装的pAdEasy-FGF1感染山羊肌内前体脂肪细胞,检测感染前后FGF1的表达变化。【结果】成功构建了腺病毒超表达载体p AdEasyFGF1,并在293A细胞中成功包装,其感染山羊肌内前体脂肪细胞能显著上调FGF1 mRNA的表达水平。【结论】说明FGF1基因可以通过感染重组腺病毒表达载体pAdEasy-FGF1在山羊肌内前体脂肪细胞中实现超表达。
关键词：
山羊 成纤维细胞生长因子1 腺病毒
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐世永 丁红梅 孙岩 王蒙 蔡亚飞 刘红林
以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因构建复制缺陷型慢病毒载体生产病毒,以病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞,并进行鸡囊胚注射,观测外源基因的表达情况。试验结果表明,在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达,其中在HeLa、293FT细胞中的转染效率约1×108TU.mL-1(TU:转染单位),在C127细胞中为5×107TU.mL-1,在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中约为1×106TU.mL-1,病毒在鸡原生殖细胞(cPGC)中转染效率最低为1×102TU.mL-1。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒载体注射鸡囊胚获得了可直接活体观察绿色荧光信号的转基因鸡,转基因效率约...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
靳晓霞 罗海玲 许旭 闫乐艳 葛素云 刘昆 袁飞
为构建绵羊血管内皮生长因子(VEGF)基因siRNA载体并对其在绵羊颗粒细胞中的表达,采用DMEM/F12培养液对绵羊卵巢颗粒细胞进行体外培养,采用脂质体转染法将干扰载体转染到颗粒细胞中,用ELISA试剂盒测定转染后各组颗粒细胞中VEGF的表达量。转染阳性对照载体PGC的颗粒细胞组为对照组,转染PGC-1、PGC-2和PGC-3的颗粒细胞组分别为试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ。与对照组相比,各试验组中VEGF的表达量分别降低了55.37%、81.45%和73.29%,其中载体PGC-2所转染的细胞中VEGF的表达量最少,说明在3个载体中,PGC-2对VEGF的基因沉默效果最好。
关键词：
绵羊 血管内皮生长因子 颗粒细胞 转染
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王杰 奥旭东 李文斌 白海栋 岳永莉 于海泉
【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fab...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
吴丹 胡兰
为了确定MSTN RNAi双元表达载体pEGFP-N1-M1-M2对成肌细胞增殖和分化的影响,利用脂质体介导法将该双元表达载体转染成肌细胞,MTT法检测MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖的作用,Giemsa染色检测pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体对成肌细胞融合率的影响。试验结果表明,pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体有促进成肌细胞增殖和分化的作用,能够促进成肌细胞大量融合。该结果为进一步探讨MSTN基因的作用机理提供了更为便捷的研究方法。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姬改革 朱春红 陶志云 刘宏祥 宋迟 李慧芳
［目的］本文旨在探讨ＩＧＦ－Ⅰ和ＭＳＴＮ基因在鸭胚胸肌成肌细胞的表达规律。［方法］以生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验对象，采用实时荧光定量ＰＣＲ方法检测鸭１３、１５、１７、１９、２１和２３胚龄时胸肌成肌细胞ＩＧＦ－Ⅰ、ＭＳＴＮ ＭＲＮＡ的表达情况，并进行品种间比较。［结果］ＩＧＦ－Ⅰ与ＭＳＴＮ ＭＲＮＡ表达都呈先升后降的趋势，都存在１７胚龄的表达高峰，１９胚龄之后，表达显著下调并持续至２３胚龄；高邮鸭ＩＧＦ－ⅠＭＲＮＡ的表达比金定鸭多了１３胚龄的表达高峰，且在１３胚龄时，２个基因的表达量都是高邮鸭极显著高于金定鸭（Ｐ
关键词：
鸭 胚胎 成肌细胞 IGF-Ⅰ MSTN
[期刊] 华北农学报
[作者]
张瑞杰 苗向阳
构建并鉴定了针对绵羊抑制素α亚基(INHA)基因的shRNA(Small hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,为进一步制备优质、高产转基因绵羊奠定基础。设计并合成4条针对绵羊INHA基因的shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及2条阴性对照序列(NC1、NC2),将其分别连接到空载体pGFP-V-RS中,得到4个shRNA表达载体(即shRNA干扰载体)pGFP-V-RS-shRNA和2个阴性对照载体pGFP-V-RS-NC;同时构建绵羊INHA的高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA,然后将构建好的4个shRNA干扰载体及2个阴性对...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
贾斌 赵茹茜 剡根强 雒秋江 陈杰
罗米丽×中国美利奴 (新疆军垦型) 杂交一代断奶母羔 214只, 随机分成两组, 在日粮中分别添加 3 5 (试验组) 和 0g·kg-1 (对照组) 生长调节剂CT2000 (半胱胺盐酸盐), 实验期为 120d。于试验前和试验结束时称重, 采毛和皮肤样品, 测定母羔生长速度, 羊毛长度、细度、强度、弯曲度和羊毛油汗颜色, 并用反转录多聚酶链式反应 (RT PCR) 方法, 定量分析绵羊皮肤中生长激素受体 (GHR)、胰岛素样生长因子 1 (IGF 1) 和胰岛素样生长因子 1型受体(IGF 1R)mRNA的相对丰度。实验结果显示, 与对照组相比较, 试验组平均日增重提高 12 77%...
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