为了克隆巴马小型猪细胞色素P4503A46基因,建立P4503A46稳定表达肝癌细胞株(Hep G2-P4503A46),并探究其药物代谢活性,通过RT-PCR从肝组织中钓取基因P4503A46,将基因与真核表达载体pc DNA3.1连接并转染Hep G2细胞,经G418筛选10代,获得稳定表达重组细胞株Hep G2-P4503A46,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)探针药物,将探针药物与重组细胞在优化的细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将对照组进行比较分析。结果表明,本研究成功从人Bama小型猪肝组织克隆了P4...

采用基因克隆技术获取草鱼(Ctenopharyngodon idellus)细胞色素P450 3A(CYP3A)cDNA序列长1 849 bp,包含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)1 542 bp,1个终止密码和含polyA信号3′UTR;ORF编码514个氨基酸,含信号肽(29 aa),2个跨膜螺旋区(23 aa,23 aa),血红素结合域(21 aa)和6个底物识别位点(SRS1-6);与其他脊椎动物CYP3A氨基酸序列相似度达60%～92%。用实时定量PCR和分光光度计法分别研究了草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney ...

为了构建剑尾鱼脑细胞系并探讨其细胞色素P4501a(CYP1A)基因的诱导效应,实验通过胰蛋白酶消化法对剑尾鱼脑组织进行体外培养,经连续继代培养,建立了可稳定传代的脑细胞系,命名为SFB。SFB最适培养液为含有15%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12和L-15等比混合培养液,培养条件为27℃,5%CO2。生长特性研究表明,第65代细胞的群体倍增时间为43.048h,显示出旺盛的生长和分裂能力。染色体分析发现,培养细胞的染色体众数为48条,SFB核型公式为2n=2st+46t,臂指数(NF)=48,与剑尾鱼一致。诱导实验表明,SFB在10-8～10-5mol/L的苯并(a)芘诱导下,CYP1...

【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD_(50)处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶(P450)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)的活性变化。利用Illumina HiSeq~(TM) 2500高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因(DEG),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证3个P450基因并分析6个P450基因(CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc)在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数(RR)分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD_(50)处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST(CDNB和DCNB为底物)及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD_(50)处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1 859 bp,开放阅读框(ORF)为1 629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。

根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序列。对草鱼与其它物种PXR氨基酸序列进行同源性比较,用以鉴定其在物种中的进化。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织PXR和细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)基因mRNA相对含量,结果表明,其表达丰度依次为:...

【目的】细胞色素P450(CYP450)是植物三萜皂苷代谢通路中的关键酶,本文从生物信息学角度对其蛋白特性及亲缘关系进行分析。【方法】从已发表的文献及NCBI中搜集植物细胞色素P450序列,分别使用ProtParam、ORFfinder、SignalP4.1、SOPMA、CDD和MEGA6.0工具对其理化性质、开放阅读框、信号肽、二级结构、保守结构域和亲缘关系进行分析。【结果】获得21种植物的23条细胞色素P450序列;这23条序列在基因序列长度、氨基酸数目,pI及氨基酸组成,均表现出较强的一致性;只有美洲商陆、甜菜和甜椒这3条序列有信号肽;二级结构具有明显的一致性,并且α-螺旋和无规则卷曲是主要的结构元件;大多数植物细胞色素P450的保守结构域同属于P450超家族;进化树表明细胞色素P450差异较小。【结论】这21种植物的细胞色素P450蛋白特性差别不大,进化距离也比较近,显示细胞色素P450具有较高的保守性和稳定性。本文将为细胞色素P450酶学特征分析及植物中三萜皂苷代谢研究提供帮助。

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,

以20～35 g克氏原螯虾为研究对象，随机分为4组，每组60尾，在基础饲料中分别掺拌0(C0组)、10(C10组)、20(C20组)、30 mg/kg(C30组)氟苯尼考喂养20 d，再改用基础饲料喂养15 d进行消除试验，测定肝胰腺Ⅰ相药物代谢酶7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶（ECOD）、7-乙氧基异吩恶唑酮-O-脱乙基酶（EROD）、苯胺-4-羟化酶（AH）、红霉素-N-脱甲基酶（ERND）、氨基比林-N-去甲基化酶（AND）和Ⅱ相药物代谢酶谷胱甘肽S-转移酶（GST）、磺基转移酶（SULT）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）活力变化，以及细胞色素P450(CYP450)、GST、热休克蛋白HSP70和金属硫蛋白（MT）mRNA表达水平的变化。结果显示，氟苯尼考显著抑制Ⅰ相药物代谢酶活力，但能诱导Ⅱ相药物代谢酶活力升高（P

【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞（Ｓｆ９）中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因ＲｊＡＡ１７ｆ。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达ＲｊＡＡ１７ｆ毒蛋白，并用蛋白质印迹对其进行检测；测定ＲｊＡＡ１７ｆ毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化，并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和ＷｅＳｔｅＲｎ ｂｌｏｔ检测验证，神经毒素基因ＲｊＡＡ１７ｆ的重组ｂＡｃｍｉｄ已经成功转染到Ｓｆ９细胞中，且在Ｓｆ９中表达出与预测大小一致的ＲｊＡＡ１７ｆ目的蛋白；此毒蛋白作用于棉铃虫中肠３～１２ｈ后，中肠膜电位与ｃＫ相比差异显著，且随着作用时间的延长，棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势，作用９ｈ．．．

本研究以重要的海水养殖鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象，克隆了其白细胞介素12 (IL-12)的p35a亚基和p40c亚基的基因编码区序列，编码区长度分别为651 bp和984 bp。系统进化树分析显示，半滑舌鳎的p35a和p40c分别与其他鱼类对应的基因聚为一支。氨基酸同源性分析显示，p35a与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似性最高，p40c与三棘刺鱼(Gasterosteus aculeatus)相似性最高，分别为52.04%和48.67%。组织表达分析显示，p35a在鳃、脑、心和卵巢中表达量较高，p40c在肝、脾、鳃和心中表达量较高。通过哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染实验，分析了半滑舌鳎p35a、p40c及其相关基因(ifn-γ和il-10)在哈维氏弧菌感染过程中的表达模式，p35a在脾中，48 h表达显著上升(P

为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性，利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征，比较了３种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制，克隆了半滑舌鳎ＰＯＭＣ基因的Ｃ ＤＮＡ序列。结果显示，黑色素细胞较大，含黑色和棕色的色素颗粒，有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态；黄色素细胞较小，含黄色素颗粒；虹彩细胞最小，含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎ＰＯＭＣ基因的Ｃ ＤＮＡ序列长９１０ ｂＰ，包括一个１１４ ｂＰ的５＇非翻译区和一个１５４ ｂＰ的３＇非翻译区，开放阅读框长度为６４２ ｂＰ，共编码２１３个氨基酸，包含ＡＣＴＨ、α．．．

为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性,利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征,比较了3种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制,克隆了半滑舌鳎POMC基因的c DNA序列。结果显示,黑色素细胞较大,含黑色和棕色的色素颗粒,有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态;黄色素细胞较小,含黄色素颗粒;虹彩细胞最小,含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎POMC基因的c DNA序列长910 bp,包括一个114 bp的5'非翻译区和一个154 bp的3'非翻译区,开放阅读框长度为642 bp,共编码213个氨基酸,包含ACTH、α...

旨在通过分子水平和组织学水平阐明牦牛不同被毛颜色的机理。采用实时荧光定量PCR技术检测皮肤组织中决定色素形成通路中的主效基因:鼠灰色基因(Agouti signaling protein gene(ASIP),Agouti)、小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor,MITF)、黑色素皮质素受体1基因(Melanocortin 1 receptor,MC1R)和酪氨酸酶基因(Tyrosinasegene,TYR)表达量。结果表明:M

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COXⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(Epinephelus awoara)细胞色素C氧化酶亚基I基因。研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5'端非编码区3bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同...