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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李平花 白兴文 卢曾军 孙普 郭建宏 李冬 曹伟军 陈应理 刘湘涛 殷宏 刘在新
【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒...
[期刊] 华北农学报
[作者]
曹伟军 李平花 白兴文 卢曾军 孙普 刘在新
利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘新生 王永录
以AF/72RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRI酶切法鉴定。应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld、A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比。结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639bp,编码213个氨基酸。不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位。本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定...
关键词：
口蹄疫病毒 T细胞表位 VP1蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 方玉珍 潘丽 蒋守田 吕建亮 刘力宽 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
蒋韬 梁仲 陈涓 何继军 吕律 马维民 刘在新 刘湘涛
【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王文秀 顾节清 陈德坤 邓文 潘丽 王宝琴 王永录 张永光
将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 潘丽 方玉珍 刘力宽 蒋守田 吕建亮 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增3D聚合酶基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF723D聚合酶的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析3D聚合酶的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位进行筛选鉴定,结果显示,表位3D2和3D4为病毒株AF72 3D聚合酶的优势B细胞表位,该结果将为进一步的FMDV多表位疫苗研究奠定基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 曾君祉 陈耀锋 黄华
为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨苏珍 张改平 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...
[期刊] 华北农学报
[作者]
周建华 丛国正 常惠芸
将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01)。利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异...
[期刊] 华北农学报
[作者]
盛蓉 宋艳华 胡波 范志宇 姜平 薛家宾 魏后军 王芳
为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴...
[期刊] 华中师范大学学报(自然科学版)
[作者]
沈超 曾一歌
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)能引起偶蹄动物患一种名为口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）的高度接触性、发热性、急性的传染病。FMD的大规模爆发会导致整个国家或地区的动物和动物相关制品产量降低、贸易受限，造成巨大的经济损失。FMDV持续感染是造成FMDV容易蔓延并难以根除的重要原因。该文综述了FMDV持续感染期间病毒在体内的存在位置与感染特性，并以病毒与宿主细胞、宿主免疫系统之间的相互作用为重点，介绍了持续感染相关机制研究进展，总结了疫情防控相关策略，以期为解决FMDV持续感染问题提供参考。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘大飞 刘明 刘春国 杨涛 万春和 陈浩 齐金龙 杜金玲 李洪涛 孙恩成 刘大程
【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周HI抗体...
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