为阐明高渗透压甘油激酶在链格孢菌中的功能,通过遗传学手段,构建了细极链格孢菌(Alternaria tenuissi-ma)cDNA酵母表达文库,并对其进行筛选而获得细极链格孢菌高渗透压甘油蛋白激酶AtHOG1基因,该基因全长1 539 bp,编码355个氨基酸。AtHog1p含有MAPK保守的激酶激活区域"TGY",与来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AfOsm1p(XP-752664)、稻瘟菌(M.grisea)MG01822(XP-363896)及酿酒酵母(S.cerevisiae)ScHog1p(AAB67558)高度同源,相似性分别为94%,90%和80%。在...

同源异型盒基因在决定植物的形态建成中发挥着重要作用。采用RT-PCR和RACE技术,从麻竹中分离到1个同源异型盒基因,其cDNA全长1 452 bp,编码1个330个氨基酸的蛋白,包含1个KNOX1区、1个KNOX2区、1个ELK区和1个Homeobox区,属于KNOX蛋白,该基因命名为DlKNOX1(GenBank No.KF709955)。组织表达特异性分析表明,DlKNOX1在节中的表达量最高,茎和鞘中次之,而在叶片中最低。将DlKNOX1置于35S启动子控制下,构建到载体pPZP的多克隆位点并转化拟南芥。RT-PCR分析表明,DlKNOX1已在转基因植株中表达。转基因植株表型变化明显,...

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。

[目的]本文旨在探索茄子SmICE1(Inducer of CBF expression 1)基因在低温响应和花青素合成途径中的功能。[方法]以光敏型茄子品种‘蓝山禾线’为材料，通过同源克隆获得SmICE1基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析；4℃低温处理4叶期的茄子幼苗，分析SmICE1基因的表达水平；构建植物表达载体PHB-SmICE1-YFP,通过农杆菌介导法在烟草叶片中进行瞬时转化，研究SmICE1蛋白的亚细胞定位；通过农杆菌蘸花法在拟南芥中过表达SmICE1基因，分析转基因植株的耐寒性、生理指标及AtCBF(CRT binding factor)基因表达情况；将PHB-SmICE1-YFP农杆菌和SmCBFpro-LUC农杆菌菌液瞬时共转入烟草细胞中进行双荧光素酶试验；构建诱饵载体SmYABBY-pGBKT7和猎物载体SmICE1-pGADT7转化至酵母感受态AH109中进行酵母双杂交试验；构建植物表达载体SmYABBY-nYFP和SmICE1-cYFP,利用注射法将其农杆菌转化至烟草细胞中进行双分子荧光互补试验。[结果]克隆获得茄子SmICE1基因，其含有1 524 bp的开放阅读框，编码507个氨基酸，预测相对分子质量为54.75×10~3,理论等电点为5.6。多序列比对和进化树结果显示SmICE1与番茄SlICE1同源关系最近。荧光定量PCR表明SmICE1基因的表达受低温诱导。亚细胞定位显示SmICE1蛋白定位在细胞核中。SmICE1蛋白具有转录激活活性，双荧光素酶试验表明SmICE1可以促进SmCBF的表达。在拟南芥中异源过表达SmICE1基因可以增强植株的抗寒性。低温处理后，转基因植物的脯氨酸含量和AtCBF基因的表达量高于野生型，而电解质渗透率低于野生型。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明SmICE1与SmYABBY蛋白存在相互作用。[结论]SmICE1可以诱导SmCBF表达并增加转基因植株的抗寒性，SmICE1与SmYABBY互作可能参与调控茄子花青素生物合成。

为挖掘红麻雄性不育核基因,解释红麻花蕾败育的分子机理,通过分析转录组数据,利用同源克隆的方法从红麻花药中克隆出拟南芥MALE STERILITY1(MS1)的同源不育基因,并命名为HcMS1基因。利用生物信息学方法对HcMS1蛋白进行结构、理化性质及亲缘关系等分析,并通过qRT-PCR分析HcMS1基因在红麻不育系、保持系不同时期的表达水平;构建过表达载体,利用叶盘法转化本氏烟草并对转基因烟草进行表型观察。HcMS1基因序列开放阅读框(ORF)为1 950 bp,编码649个氨基酸。生物信息学分析显示,HcMS1蛋白为亲水蛋白,定位在细胞核上且含有典型PHD-finger结构域,没有信号肽和跨膜区结构,与陆地棉MS1蛋白亲缘关系最近,其次为木槿MS1蛋白。qRT-PCR结果表明,HcMS1基因的表达量在保持系和不育系中均呈现先上升、后下降的趋势,且在红麻花蕾的四分体至单核期表达量最高,这与拟南芥中MS1基因表达模式一致;另外在保持系中基因的表达水平显著高于不育系,推测红麻败育与HcMS1基因的低量表达相关。通过遗传转化试验发现,HcMS1转基因烟草株型较矮,花萼大小不一,花筒长度缩短,并出现自交不结实的现象,说明红麻HcMS1基因的异源表达有影响本氏烟草正常育性的功能。从红麻花药中成功克隆出核不育相关基因HcMS1,并对其进行功能分析,为后续红麻雄性不育育种工作提供了一定的理论依据与基础。

[目的]本文旨在分析不结球白菜BcICE1基因的表达模式并探索其在冷胁迫中的功能。[方法]以不结球白菜品种‘NHCC001’为材料,采用同源克隆的方法获得BcICE1基因的全长序列,并进行生物信息学分析;对‘NHCC001’进行4℃低温和PEG-6000模拟干旱处理,检测BcICE1基因对胁迫的响应;构建过表达载体pEarly Gate-BcICE1,利用注射法将载体农杆菌菌液导入烟草细胞进行BcICE1基因的瞬时表达并检测;构建酵母诱饵载体p GBKT7-BcICE1,转化AH109验证其转录激活活性;将pEarly Gate-BcICE1农杆菌菌液利用蘸花法进行BcICE1基因的遗传转化,并用RT-qPCR和Western blot对阳性苗进行鉴定。通过RT-qPCR对BcICE1过表达拟南芥中冷胁迫相关基因的表达水平进行分析。[结果]克隆获得不结球白菜BcICE1基因,其含有1 338 bp的开放阅读框,编码466个氨基酸,相对分子质量为47.40×103,等电点为5.42;氨基酸的多序列比对和系统进化树结果表明,BcICE1蛋白与欧洲油菜、荠菜和拟南芥ICE1蛋白同源关系较近。亚细胞定位表明BcICE1蛋白定位在细胞核中,具有转录激活性且对冷胁迫与干旱胁迫有响应。BcICE1过表达株系能增强植株的抗寒性,同时在低温处理后BcICE1过表达植株中冷胁迫相关基因At CBF3和COR15A的表达量显著高于野生型植株。[结论]克隆并获得BcICE1过表达拟南芥植株,功能分析表明BcICE1基因能增强植株抗寒性。

为了分析AP1的表达调控模式,本研究克隆了拟南芥花异常株系AFDL的AP1启动子,启动子元件预测结果表明:AP1启动子中含有3个结合MADS调控因子的CArG box(从5'依次编号为CArG1、CArG2、CArG3),通过删减AP1启动子长度以及改变CArG box数量构建了5个GUS表达载体并转化野生型拟南芥。测序结果显示:AFDL的AP1启动子在核苷酸序列上与野生型拟南芥完全一致,这表明AP1在AFDL中的表达显著降低并不是启动子序列突变引起的;转基因植株的GUS表达模式说明了CArG1在花发育早期及后期激活基因的表达,CArG2在整个后期都对基因的表达有抑制作用,而CArG3在花发育...

以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模版,逆转录获得cDNA;以cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增,得到苹果酸通透酶(mae1)基因,将其与pMD-18T连接并测序.结果表明cDNA全长为1316 bp,编码438氨基酸,分子质量49ku,与已报道的mae1基因序列的同源性达到99%.mae1与整合型表达质粒pSH47连接后,用重组的表达质粒转化产朊假丝酵母,经PCR验证筛选阳性克隆子.通过对转化子的摇瓶筛选,发现重组子的降酸幅度均大于原始菌株,培养40 h降解了48.6%的L-苹果酸,降解率比原始菌株提高了9.8%.

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因ＰｓＰＬ１的功能，确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用，为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用ＲＡＣＥ技术扩增ＰｓＰＬ１基因全长，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ对ＰｓＰＬ１的表达特征进行分析，并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能，最后通过ＨＩＧｓ技术沉默ＰｓＰＬ１基因，确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到ＰｓＰＬ１基因全长，其ＯＲＦ长４７１ｂＰ，编码１５７个氨基酸；经预测ＰｓＰＬ１蛋白包含一个果胶酶保守结构域，Ｎ端含有一段由２１个氨基酸组成的信号肽序列；经酵母系统验证，确定ＰｓＰＬ１蛋白信号肽具有分泌功能；ｑＲＴ－ＰＣＲ分析发现，Ｐ．．．

【目的】克隆水稻镉（Cadmium，Cd）响应基因OsGLP1-2，并对其进行生物信息学及Cd胁迫处理的表达模式分析，为探索OsGLP1-2基因在水稻中应对重金属胁迫的分子机制提供基础。【方法】以水稻为材料，利用PCR克隆OsGLP1-2基因，并利用生物信息学方法对其顺式作用元件、二级结构和疏水性等进行分析，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在100 μmol/L Cd处理下，水稻茎部和根部中的表达特征，再利用转基因酵母进行Cd耐受性分析。【结果】水稻OsGLP1-2基因编码区（CDS）序列长度为651 bp，编码216个氨基酸，其编码蛋白的相对分子量为22.48 kDa，理论等电点（PI）为7.16，为稳定性的中性疏水性蛋白，含有Cupin结构域，属于Cupin家族，该家族在植物防御等方面发挥着重要作用。同源家族进化树表明该基因是单独的一支，但与大麦HvGER5a的亲缘关系最为接近，表明OsGLP1-2可能具有HvGER5a类似的功能。二级结构分析结果表明该蛋白含有10个β折叠、8个α螺旋和17个无规卷曲结构。并且OsGLP1-2具有光、干旱等环境诱导相关的调节元件以及生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等激素相关调节元件，表明目的基因可能参与水稻对非生物胁迫的响应。100 μmol/L Cd处理下，在6 h时地上部分目的基因的表达水平约为对照组3倍，且地下部分也为对照组的3倍，即OsGLP1-2基因能对Cd产生响应。最后斑点实验表明该基因在酵母中无明显表型。【结论】成功克隆了水稻OsGLP1-2基因，且该基因对Cd有一定的响应，可为水稻应对重金属胁迫的反应机制提供参考依据。

【目的】克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温(4℃)表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物(大豆、拟...

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能，为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础。[方法]lf1为水稻品种‘02428’组织培养获得的叶片融合突变体。利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种‘N22’构建遗传分离群体，精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因，经基因敲除克隆LF1;分析该基因的表达模式和蛋白的亚细胞定位。[结果]从lf1/N22的F_2群体中，挑选10株突变个体和10株正常个体，将lf1定位在第6染色体上InDel6-6和RM30标记之间；进一步利用256株极端个体，经加密标记，最终将lf1精细定位在标记InDel6-6和RM6818之间约3.2 Mb区间内；通过对野生型‘02428’和lf1进行重测序分析，发现‘02428’与lf1在定位区间的9个基因存在差异，其中6个为转座子基因，1个为表达蛋白基因，1个为假定蛋白基因，1个为NAC转录因子基因Os06g0344900。与野生型‘02428’相比，lf1中Os06g0344900第1外显子存在1个33 bp的缺失，导致11个氨基酸的缺失，据此将该基因确定为LF1的候选基因。利用CRISPR/Cas9技术，获得4个不同类型的敲除株系，均表现出突变体的表型。上述结果表明，Os06g0344900即为目的基因LF1。qRT-PCR分析表明，LF1呈现组成型表达，且在幼穗中表达量最高。亚细胞定位显示LF1定位于细胞核中。[结论]水稻突变体lf1的叶片融合性状由6号染色体的Os06g0344900基因突变所致。该基因的克隆及初步功能分析为解析水稻叶片的发育调控机制奠定了基础。

【目的】花器官发育是影响花观赏价值的重要因素，AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用，旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。【方法】以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因，通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术，对SvAP1基因进行功能预测与分析。【结果】SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp，编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示：SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族，C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明：SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示：与野生型龙葵相比，转基因龙葵雌蕊发育异常，表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。【结论】欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育，与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异，即转基因龙葵雄蕊无明显变化且雌蕊未转变为萼片状或叶片状器官。这可能与欧洲千里光花器官调节机制和花序结构的复杂性有关。由此可知，欧洲千里光SvAP1基因可能作为花器官特征基因在花器官形成中具有重要作用。图6表1参35

为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time P

为了阐明鱼类TANK结合激酶1（TBK1）在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用，本实验通过cDNA末端快速扩增技术（SMARTRACE）从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列，命名为AjTBK1，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式（PAMPs）及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响，通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示，日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸，其三维丝带空间结构与人类TBK1相似，具有保守的激酶结构域（KD）、泛素样结构域（ULD）、二聚化支架结构域（SDD）以及C端结构域（CTD），在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达，且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后，AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高，而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中，经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布，经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外，双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路，在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。