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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 杨志军 王群 渡部终五
【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(N...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 姬明丽 张军华 千智斌
从红鳍东方鲀（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）肝脏组织中提取总ｒＮａ，通过ｒＴ–ｐＣｒ扩增，获得ｓｉｒＴ３基因的编码阅读框（Ｏｒｆ），用原核表达载体ｐ ｅＴ３２ａ（＋）构建ｐ ｅＴ３２ａ／ｓｉｒＴ３重组质粒，用异丙基–β–Ｄ–硫代半乳糖苷（ｉｐＴｇ）将重组质粒ｐ ｅＴ３２ａ／ｓＴｒＴ３在大肠杆菌ｒＯｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）进行诱导表达，并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示，红鳍东方鲀ｓｉｒＴ３基因（Ｔｒ ｓｉｒＴ３）Ｏｒｆ区大小为１ ２６３ ｂｐ大小，编码４２０个氨基酸。经ｉｐＴｇ诱导表达后，获得１个带组氨酸（Ｈｉｓ）标签的融合蛋白，目的蛋白主要存在于上清溶液中，为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张伟 姬明丽 郭前进 千智斌
为了研究红鳍东方鲀ＳＲＥＢＰ－１和ＳＲＥＢＰ－２基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方鲀脂肪组织提取总ＲＮＡ，反转录获得ｃ ＤＮＡ模板，利用设计的引物ＰｃＲ扩增获得ＳＲＥＢＰ－１和ＳＲＥＢＰ－２开放阅读框（ＯＲＦ），ＳＲＥＢＰ－１基因ＯＲＦ区的ｃ ＤＮＡ序列长度为３ ３３０ ＢＰ，编码１ １０９个氨基酸，ＳＲＥＢＰ－２基因ＯＲＦ区的ｃ ＤＮＡ序列为３ ４４４ ＢＰ，编码１ １４７个氨基酸。实时荧光定量ＰｃＲ检测ＳＲＥＢＰ－１基因在红鳍东方鲀不同组织中的表达特征，结果表明，ＳＲＥＢＰ－１在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将ＳＲＥＢ．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
江学斌 马苗鹏 肖淑君 司徒嘉欣 杨军 施巨清 蔡海明 张玲华
根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。
关键词：
猪 SIRT1 PCR 多克隆抗体
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
谷文峰 李新华 刘希颖 胡兰
用RT-PCR扩增含有XhoI/EcoRI酶切位点的Sirt1片段,克隆、测序后,构建真核荧光表达载体pEGFP-N1-Sirt1、脂质体介导转染293细胞,最后利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明,经脂质体介导重组体pEGFP-N1-Sirt1可成功转染293细胞;转染48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达;SDS-PAGE证明表达的融合蛋白相对分子质量约为41kD。该结果为进一步研究Sirt1在哺乳动物细胞中的作用奠定了基础。
关键词：
Sirt1 基因克隆 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
李彬 毛立 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良...
关键词：
猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
王建平 陈吉刚
鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子。根据B ird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀(Fugu rubripes)白介素-2的核苷酸序列。该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白。序列分析表明,红鳍东方鲀IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34%~44%和24%~43%之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。遗传进化分析表明,红鳍东方鲀IL-2在遗传进化上具有其独立性。
关键词：
红鳍东方鲀 白细胞介素-2 克隆
[期刊] 华北农学报
[作者]
邓淑贞 王斌 高磊 牛倩雅 刘涛 翁曼丽 郭宝太
以叶状体总DNA为模板,用3对DNA引物进行PCR扩增,获得了坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PhTPS)3个重叠的片段,大小分别为1.3,1.1,0.7 kb。用pMD18-T载体克隆这些片段,经测序与序列拼接获得了该基因完整的ORF序列,其长度为2 727 bp。在已经构建条斑紫菜TPS基因原核表达载体pET22b-PyTPS的基础上,用PhTPS基因替代该表达载体中的PyTPS基因,获得了PhTPS基因的原核表达载体pET22b-PhTPS。重组菌BL21(pET22b-PhTPS)经IPTG诱导,SDS-PAGE显示获得了约100 kDa的特异性蛋白条带;目测及OD600的测定结果表明...
[期刊] 华北农学报
[作者]
任瑛 赵美爱 郭新梅 裴玉贺 宋希云
为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
马思思 喻伟峰 张凯 张雯雯 唐晓东 刘雨曦 尹绍武 王涛
为探究暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)TGF-β1基因与其生长性状的关联及作用，本研究采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀TGF-β1基因，分析了其基因结构与表达特征，并通过直接PCR扩增法对TGF-β1基因进行多片段比对，在此基础上筛选出与生长性状相关的SNP位点。研究发现TGF-β1基因cDNA全长共2217 bp，包含5’UTR 51 bp，3’UTR 1014 bp，ORF 1152 bp，编码383个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明暗纹东方鲀TGF-β1基因与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高(92.82%)。进化树分析表明暗纹东方鲀TGF-β1基因编码氨基酸序列与红鳍东方鲀聚为一支，与鲈形目鱼类亲缘关系最近(68.46%～73.33%)。qRT-PCR检测显示TGF-β1基因在暗纹东方鲀8种不同组织(心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、中肠和鳃)都有表达，其中肾脏表达量最高，心脏和脾脏表达量次之。通过SNP位点不同基因型与个体生长性状的相关性分析，发现TGF-β1上的SNP g. 3908 C＞A位点与暗纹东方鲀多项生长性状有关，其中CC型是优势基因型，且CC型个体体宽、肥满度较高。研究结果证实了TGF-β1基因与暗纹东方鲀生长性状有一定的相关性，有望为暗纹东方鲀分子标记辅助育种提供基础资料。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张飞燕 王振华 潘康成 唐慧琴 谷笑笑 李伟
旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟
[期刊] 华北农学报
[作者]
王亚男 梁岩岩 严文培 张银萍 李强 吴秀菊
为进一步挖掘甲基丁香酚合成相关酶基因，解析北细辛次生代谢途径，根据北细辛转录组数据库信息，筛选和克隆了AhOMT1基因，并进行了相应的生物信息学分析及原核表达分析。结果表明，AhOMT1基因包含的开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸，理论分子质量为40.23 ku,等电点为5.34,AhOMT1蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽序列；AhOMT1基因具有二聚化结构域与甲基转移酶结构域，AhOMT1与催化类黄酮、丁香酚类化合物的O-甲基转移酶的同源性较高；构建pET-32b-AhOMT1原核表达载体，成功诱导表达约60 ku的重组蛋白；确定了最佳诱导条件是0.2 mmol/L IPTG,16℃诱导16 h,该诱导条件下的重组蛋白多以可溶性蛋白形式存在；使用Ni~(2+)树脂分离纯化AhOMT1蛋白，以200 mmol/L咪唑洗脱可得到最大量的蛋白。该研究首次克隆了北细辛AhOMT1基因，构建原核表达载体，筛选出AhOMT1蛋白最佳诱导条件。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨莹莹 张其中 李春涛 陈霞 朱成科 李超
白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3'非编码区域(UTR)为224 bp,5'UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
尹经逵 史燕 朱新平
对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的干扰素调节因子(1Interferon regulatory factor1,IRF-1)基因进行了克隆、测序及原核表达。以PBS做对照,利用polyI:C刺激斜带石斑鱼,然后取其肝脏、头肾、脾脏提取总RNA,随机引物反转录获得cDNA。根据相近物种IRF-1的保守序列设计引物,通过PCR得到了保守片段,通过RACE-PCR获得了斜带石斑鱼IRF-1基因的全长cDNA。基因全长为1730bp,完整开放阅读框(ORF)906bp,编码302个氨基酸,5′非编码区153bp,3′非编码区671bp。将斜带石斑鱼ORF与其他物种进行比对发现,...
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