红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)为暖温性、广温性鱼类，低温的冬季海水会对其生存造成很大影响，因此，选育具有抗寒性状的品系对其产业发展具有重要意义。本研究在利用QTL (quantitative trait locus)定位分析筛选出6个与红鳍东方鲀耐低温相关候选基因(tacc2、fsip1、exoc4、arhgap44a、pde10a和unc5b)的基础上，通过Real-time PCR检测这6个基因在低温胁迫下在肝脏、心脏和肾脏中表达量的变化。实验用鱼为课题组建立的同一家系的8月龄鱼，共设置3个温度梯度(8℃、13℃和18℃)，8℃和13℃为低温组，18℃为对照组。结果显示，6个基因在不同温度下的3个组织中均有不同程度的表达。其中，pde10a基因在3个组织中的表达均呈先升高后下降的趋势；tacc2和exoc4基因在肝脏、肾脏以及心脏8℃组中的表达分别呈先下降再趋于稳定、先升高再趋于稳定和先上升后下降的趋势；unc5b基因在肝脏和心脏中的表达量较低，肾脏低温组在实验前期呈现高表达；arhgap44a基因在肝脏中的表达呈上升趋势，在心脏和肾脏中整体表达无明显变化；fsip1基因在肝脏中的表达呈下降趋势，在心脏和肾脏中的表达呈先上升后下降的趋势。这6个基因在红鳍东方鲀组织中均随着时间和温度变化具有差异性表达，在低温胁迫下呈现积极响应，表明这6个QTL候选基因在红鳍东方鲀低温适应中具有潜在的重要作用。本研究可为红鳍东方鲀耐低温相关信号通路研究以及耐低温品种选育提供理论依据。

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。

鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节，冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制，本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃)，在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮中的表达情况。结果显示，AFP基因呈广泛性表达，在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，在5℃组达到最高值，显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，在肝、肾、脑、心、肠、皮中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在脑、心、肝和皮中也有较高的表达量；随着温度的降低，除肝脏外，各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在其他组织中表达量较低；随着温度的降低，大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明，4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同，反映了这4种基因的功能特异性；在低温胁迫下，4种基因积极响应，表达量均发生不同程度的变化，表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外，从表达变化规律来看，8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点，过低的温度会造成其调控紊乱，这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。

鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节，冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制，本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃)，在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮中的表达情况。结果显示，AFP基因呈广泛性表达，在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，在5℃组达到最高值，显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，在肝、肾、脑、心、肠、皮中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在脑、心、肝和皮中也有较高的表达量；随着温度的降低，除肝脏外，各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在其他组织中表达量较低；随着温度的降低，大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明，4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同，反映了这4种基因的功能特异性；在低温胁迫下，4种基因积极响应，表达量均发生不同程度的变化，表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外，从表达变化规律来看，8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点，过低的温度会造成其调控紊乱，这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。

为了研究红鳍东方鲀ＳＲＥＢＰ－１和ＳＲＥＢＰ－２基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方鲀脂肪组织提取总ＲＮＡ，反转录获得ｃ ＤＮＡ模板，利用设计的引物ＰｃＲ扩增获得ＳＲＥＢＰ－１和ＳＲＥＢＰ－２开放阅读框（ＯＲＦ），ＳＲＥＢＰ－１基因ＯＲＦ区的ｃ ＤＮＡ序列长度为３ ３３０ ＢＰ，编码１ １０９个氨基酸，ＳＲＥＢＰ－２基因ＯＲＦ区的ｃ ＤＮＡ序列为３ ４４４ ＢＰ，编码１ １４７个氨基酸。实时荧光定量ＰｃＲ检测ＳＲＥＢＰ－１基因在红鳍东方鲀不同组织中的表达特征，结果表明，ＳＲＥＢＰ－１在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将ＳＲＥＢ．．．

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(N...

克隆甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)低温胁迫基因Ib ICE1,对其进行序列分析及低温胁迫下表达水平分析,探讨Ib ICE1对甘薯耐低温胁迫能力的影响。以辽薯36为试验材料,利用RACE技术克隆甘薯Ib ICE1基因,Ib ICE1基因的c DNA全长2150bp,包含1611bp完整的开放阅读框,该基因编码536个氨基酸残基,分子量58.26 k D,等电点5.72。进化树分析表明,Ib ICE1同玉米和拟南芥ICE1基因亲缘关系较近。Ib ICE1蛋白C端含有一个典型的b HLH

【目的】WRKY转录因子在植物响应低温胁迫中发挥重要的调控作用，但丝瓜[Luffa cylindrica（L.) Roem.]WRKY基因家族的全基因组鉴定及其响应低温胁迫分子机制的报道较少。【方法】本研究采用生信数据处理等方法全基因组鉴定丝瓜WRKY基因家族，分析丝瓜WRKY基因家族特点、功能及表达情况，并利用LC-MC技术检测丝瓜响应低温胁迫分子机制。【结果】丝瓜全基因组中共鉴定出62个LcWRKYs，非均匀地分布在13条染色体上；系统进化树分析发现，丝瓜WRKY成员被分成3大类群(Ⅰ-Ⅲ)，第Ⅲ类群又被分成5个亚群(Ⅲa-e)；共线性分析发现，丝瓜和拟南芥(Arabidopsis thaliana) WRKY基因家族之间具有共线基因对56个，LcWRKYs基因之间具有片段复制基因对17个；分析启动子发现，LcWRKYs启动子具有顺式调控元件，多种与激素和逆境响应等相关；低温胁迫表达分析发现，4个LcWRKYs受低温胁迫显著上调表达；基于LC-MC检测获得激素JA、MEJA、SA、ABA含量，分析丝瓜响应低温胁迫分子机制，LcWRKYs含有茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸响应元件，可能参与调节丝瓜的生物学过程及逆境胁迫响应。【结论】该研究结果为解析WRKY基因在丝瓜低温胁迫响应中的作用以及WRKY基因家族的进一步功能分析提供新信息，并为后续耐低温LcWRKY功能、编辑等研究提供基础，为创制耐寒材料及培育丝瓜耐寒品种提供技术支持。

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析，挖掘相关基因，并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析，借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系；采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因，开放阅读框序列长度为1 149 bp，共编码382个氨基酸，属于GDPD家族，其中存在一个保守结构域，名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根，中量表达于花和茎，微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后，立即会对低磷胁迫做出应答，胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因，获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式，为深入解析棉花GhGDPD1基因的生物学功能以及培育棉花磷高效利用新种质提供科学参考。图7表1参18

为了探讨玉米bZIP基因家族成员在玉米抗逆中的作用，以玉米骨干自交系郑58为试验材料，设置200 mmol/L的NaCl溶液、20%PEG6000(Polyethylene Glycol 6000)、4℃低温和硝态氮或铵态氮缺乏胁迫试验，利用qPCR技术，对9个ZmbZIP基因应答各类逆境胁迫的响应表达模式进行了分析。系统进化树分析结果表明，9个ZmbZIP基因进一步细分为3个亚组。qPCR分析结果表明，8个基因在不同组织器官中表达，ZmbZIP80没有被检测到，其可能是假基因。在人为模拟盐、干旱、低温和氮胁迫条件下，8个ZmbZIP在应答不同胁迫时，呈现不同的表达模式，ZmbZIP37和ZmbZIP53受NaCl胁迫明显诱导，而ZmbZIP49和ZmbZIP79则受到显著抑制；硝态氮缺乏胁迫显著抑制叶片中ZmbZIP37和ZmbZIP53基因表达，ZmbZIP42和ZmbZIP49则受到铵态氮缺乏胁迫的明显诱导。这些结果表明，8个ZmbZIP在玉米抵御逆境胁迫时发挥着广泛的作用；9个ZmbZIP基因在玉米不同组织中和响应不同逆境胁迫时的表达模式明显不同。研究结果可为进一步研究这些基因的生物学功能提供科学数据。

【目的】对毛竹Phyllostachys edulis ICE基因家族进行鉴定及分析，找出响应毛竹抗寒关键家族成员，研究毛竹ICE基因的生物学功能、响应低温胁迫的分子机制及遗传转化，为提高毛竹抗寒性奠定理论基础。【方法】利用生物信息学方法分析毛竹ICE基因家族成员，并对4、0、-2℃低温处理0(对照)、0.5、1.0、24.0、48.0 h的毛竹生理指标和ICE基因的表达模式进行分析。【结果】共鉴定了4个毛竹ICE基因。保守结构域和多重序列比对分析表明：PeICE基因结构高度相似。系统发育关系及启动子顺式作用元件分析显示：PeICE基因与水稻Oryza sativa亲缘关系更近，同时存在大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件。活性氧自由基(ROS)染色发现随着处理时间增长，ROS染色逐渐加深，但是其0℃处理24.0 h、-2℃处理1.0 h后染色逐渐减弱。脯氨酸(Pro)质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性显示：4和0℃条件下，Pro质量摩尔浓度和SOD活性整体增加，但-2℃时低于对照。过氧化物酶(POD)活性显示：在3个低温处理下均增加。ICE基因表达模式分析发现：4、0℃处理时PeICE表达量整体增加，且都以PeICE3增量最明显；而-2℃处理下PeICE整体表达量水平低于对照。【结论】随着温度降低和处理时间增强，毛竹受到的损伤不断增强，其内酶活系统以及ICE基因积极响应低温胁迫，其中，PeICE3对低温胁迫最为敏感，但在-2℃时，ICE基因表达量并未增加，推测该基因家族响应了寒冷胁迫而非冷冻胁迫。图7表1参42

【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1914bp,其中5′端非编码区25bp,开放阅读框为...

肿瘤坏死因子受体相关因子7 (tumor necrosis factor receptor associated factor7， TRAF7)作为一种细胞内蛋白，参与信号转导，并介导宿主应激防御调控过程。为研究TRAF7在刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)，克隆了刺参TRAF7 (AjTRAF7)全长cDNA序列，分析了其结构特征和在基因组中的分布，并检测了该基因在刺参不同组织和高温胁迫过程中体壁组织中的表达变化情况。结果显示，AjTRAF7全长2 576 bp，开放阅读框(ORF)长1 770 bp，5′UTR长345 bp，3′UTR长461 bp，编码589个氨基酸，预测蛋白分子量为65.6 kDa，理论等电点(pI)为7.52。蛋白序列包含1个RING finger结构域、1个Coiled coil结构域和6个WD40结构域，N端包含1个螺旋区域。该基因预测蛋白包含41个丝氨酸磷酸化位点、20个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点，蛋白N端具有3个天冬酰胺糖基化位点。刺参基因组中比对到2个AjTRAF7基因拷贝，位于同一条染色体上，第一个拷贝包含18个外显子和15个内含子，第二拷贝包含17个外显子和14个内含子。系统进化学分析表明，刺参TRAF7氨基酸序列与蝠海星(Patiria miniata)和紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)相似性较高，分别为40.58%和38.37%，刺参与蝠海星和紫色球海胆聚在一支。qRT-PCR结果显示，AjTRAF7在健康刺参各组织中均有表达，其在雌性性腺中表达量最高，体腔细胞中表达量次之，在呼吸树、体壁、肠道、雄性性腺和纵肌中表达量依次降低，各组织间表达量差异显著(P<0.05)。在响应高温胁迫的过程中，与对照组相比，体壁组织中AjTRAF7基因表达量在第2天和第4天表达显著上升(P<0.05)，第6天基因表达开始下降。综上，AjTRAF7基因可能参与刺参应对高温胁迫的表达调控过程，相关结果将为解析刺参应对高温胁迫的分子机制提供科学依据。

为了探究暗纹东方鲀（Takifuguobscurus）组织内TTX含量与含毒组织电压门控钠离子通道基因表达特征。分别采用酶联免疫法（ELISA）测定暗纹东方鲀肝脏、心脏等8个组织TTX含量，实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测电压门控钠离子通道α亚基基因家族成员scn1aa，scn1ab，scn4aa，scn4ab，scn5aa，scn5ab，scn8aa，scn8ab（以下简称“电压门控钠离子通道基因”）在各组织中的相对表达特征。结果显示：各组织中TTX含量由高到低为脑(9.521±2.816μg/g)、心脏(4.271±1.129μg/g)、鳃(1.586±0.527μg/g)、肌肉(1.494±0.938μg/g)、肝脏(0.913±0.206μg/g)、皮肤(0.902±0.235μg/g)、肠道(0.894±0.215μg/g)和眼(0.864±0.287μg/g)，脑、心脏组织为弱毒性，肝脏、皮肤、肌肉、眼、肠道、鳃组织为微毒性。RT-qPCR结果显示scn1aa、scn1ab、scn4ab、scn5aa、scn8aa、scn8ab基因均在肝脏组织的相对表达量最高，scn4aa基因仅在肌肉组织表达，皮肤组织仅有scn4ab基因表达，且scn4ab基因在所有检测组织种均有表达，表达具有广泛性。钠离子通道基因在斑马鱼和暗纹东方鲀组织表达特征存在差异。scn4ab基因可能在东方鲀属鱼类耐受TTX分子基础中发挥重要作用。