【目的】研究红花ｍｉＲ３９７ａ前体基因及成熟基因在红花不同组织中的表达水平，并对ｍｉＲ３９７ａ基因序列、靶基因及基因功能进行分析，为深入研究红花抗逆机制提供参考。【方法】提取红花籽粒、花瓣、茎、根、叶片等５个组织材料的总ＲＮａ，使用荧光定量ＰＣＲ鉴定ｍｉＲ３９７ａ在不同组织中的表达水平；利用生物信息学方法分析红花ｍｉＲ３９７ａ基因序列，用原生质体转化方法验证红花ｍｉＲ３９７ａ调控的靶基因ＬａＣ２，并利用转基因拟南芥表型研究ｍｉＲ３９７ａ基因的功能。【结果】ｍｉＲ３９７ａ前体基因和成熟基因均能在红花不同组织中表达，且均以叶片组织中的表达量最高，分别是籽粒组织的２．５与１．９倍，差异达极显著水平；．．．

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5(BIRC5)进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示...

通过分析热应激奶牛和正常奶牛血清差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在荷斯坦奶牛发生热应激过程中的作用及其调控机制。利用miRNA高通量测序技术对奶牛血清中miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;用RT-qPCR方法验证4个在热应激奶牛血清与正常奶牛血清中显著差异表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-181a(对应激以及免疫反应可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。结果表明:miRNA高通量测序分析发现共有52个差异表达极显著miRN...

红花草莓是一种可食用的观赏花卉,花色是红花草莓最主要的观赏性状。miRNAs作为重要的转录后调节因子,在植物中发挥着重要的作用,但在红花草莓中尚未见报道。通过对红花草莓品种四季红不同发育进程的花蕾进行miRNA和降解组测序,利用趋势分析,筛选到与花色调控相关的差异FamiR156a及其差异靶基因FaSPL13A,对其进行克隆、过表达载体的构建、生物信息学分析和表达分析。结果表明:FamiR156a前体序列为104 bp,靶基因FaSPL13A编码区序列为1236 bp,并对获得的序列分别进行生物信息学分析和系统进化树构建,发现FamiR156a前体序列与蔷薇科的苹果、桃同为一个分支,FaSPL13A的氨基酸序列与蔷薇科的森林草莓和月季聚类在同一分支上,说明它们亲缘关系较近、功能相似且克隆结果准确。同时,构建了FamiR156a及其靶基因FaSPL13A过表达载体pRI-101-AN-FamiR156a和pRI-101-AN-FaSPL13A,成功转入到农杆菌中。随着花蕾的发育,花瓣的颜色逐渐加深,实时荧光定量结果发现,FaSPL13A基因在红花草莓花瓣中表达逐渐下降,而FamiR156a的表达量逐渐升高,二者表达量呈相反趋势,表明在红花草莓花瓣呈色过程中FamiR156a及其靶基因FaSPL13A是负调控的关系,从而说明FamiR156a可能调控红花草莓花瓣的着色。研究结果为揭示红花草莓花瓣花青苷的生物合成提供了转录后水平调控的分子依据,为进一步深入研究红花草莓花瓣呈色机理及分子育种奠定了基础。

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列(pri-mir-14)并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和nega...

为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中可能的功能及其作用机制奠定基础。以多个网络数据库资源为基础,通过生物信息学的方法预测可能的靶基因及其信号通路,然后利用q PCR检测miR-181a-5p及其靶基因在不同阶段颗粒层中的表达水平。结果显示,miR-181a-5p在脊椎动物中高度保守;靶基因的GO和KEGG分析发现,miR-181a-5p主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,多数靶基因主要富集到FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路;根据靶基因互作网络图,筛选出10个核心靶基因VEGFA、MAPK1、FOS、KRAS、HRAS、SIRT1、BCL2、ESR1、PTEN和CDKN1A,其中多数靶基因均与细胞增殖凋亡相关。结果表明,miR-181a-5p在2～4 mm表达量最高,但在4～6 mm急剧下降,之后在4～6 mm、8～10 mm、F5这3个阶段均呈现显著上升趋势。miR-181a-5p可能通过靶向调控SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等基因,参与FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路来调控颗粒细胞的增殖凋亡过程。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400bp含有"种子序列"的Otx23′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明:pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致; TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32dph、36dph时期,pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。

为研究番茄ｍｉＲＮＡ在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用ＲｅＡｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测番茄ｍｉＲＮＡ３９７在非生物逆境（干旱、盐害、ＡＢＡ）条件下的表达量变化，发现Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７响应这些逆境胁迫，尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７过表达载体转入拟南芥中，进行转基因功能验证。结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢，保水能力更好，且在干旱胁迫下，转基因植株的长势明显优于野生型，其最大光合效率、３种抗氧化酶活性ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡｔ均明显高于野生型，同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７能提高拟南芥对干旱．．．

【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9,并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系,探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物,以草莓叶片为试材,利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段,在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓(Fragaria×ananassa)品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列,命名为FaSP...

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coliF18菌株感染下表达量极显著上调的micro RNAs—miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守...

设计急性胁迫实验，采用实时荧光定量、生物信息学、双荧光素酶报告和体内miRNA抑制的方法，探究miR-192在尼罗罗非鱼应答碳酸盐碱度胁迫中的作用。结果如下：（1）实时荧光定量PCR实验表明，在急性碱胁迫（6g/L NaHCO_(3)）尼罗罗非鱼6h后，鳃组织中miR-192的表达显著下调，溶质转运蛋白基因(solute carriers16A7,SLC16A7）表达显著上调（P < 0.05）；（2）借助生物信息分析预测到SLC16A7可能是miR-192的靶基因；（3）利用双荧光素酶报告实验发现miR-192会与SLC16A7的3’UTR结合；（4）体内对miR-192抑制后，SLC16A7的表达显著上调（P < 0.05）。综上，本研究证实了miR-192参与了尼罗罗非鱼应答碱胁迫中的调控过程，SLC16A7是miR-192的直接靶基因。本研究为探明miRNAs调控尼罗罗非鱼应答碱胁迫的分子机制提供了一定基础。

【目的】分析鸡miR-181a的转录起始位点,并分析其在1日龄和成年鸡不同组织中的表达谱,以期为研究miR-181a的功能奠定基础。【方法】采用qPCR技术构建miR-181a在1日龄和成年鸡肝脏、脾脏、肺、小肠、大脑、小脑、下丘脑、脑干、胸腺、心脏和肾脏组织中的表达谱。用version(1.83)分析miR-181a的保守性,并采用ENCODE数据库进行miR-181a转录起始位点和启动子区域的分析。【结果】①采用qPCR检测miR-181a在鸡下丘脑中的表达量和高通量测序的结果一致,1日龄下丘脑中的表达量显著低于成年鸡的表达量(P<0.05);②miR-181a在11个组织中均有表达,且在...

ＴｈＶｈＡｃ１基因能响应干旱、盐、重金属等胁迫诱导，该基因能有效提高转ＴｈＶｈＡｃ１基因酵母的多种抗逆能力。为进一步研究ＴｈＶｈＡｃ１基因的抗逆调控机理，本研究利用酵母单杂交技术钓取ＴｈＶｈＡｃ１可能的上游调控因子，并利用基因枪瞬时共转化技术进行初步验证。酵母单杂交结果显示，ＴｈＭＹＢ３基因能识别ＴｈＶｈＡｃ１基因上游ＭＹＢ顺式作用元件和含有ＭＹＢ元件的启动子片段。ＴｈＤｏｆ２基因能识别ＴｈＶｈＡｃ１基因上游Ｄｏｆ顺式作用元件和含有Ｄｏｆ元件的启动子片段。但ＴｈＭＹＢ３和ＴｈＤｏｆ２均不能识别突变后的元件及含对应突变元件的启动子片段。将ＴｈＭＹＢ３和ＴｈＤｏｆ２分别构建成效应载体，各元件、突变．．．

【目的】鉴定葡萄miR159家族成员及其靶基因,明确葡萄miR159家族成员及其靶基因应答外源赤霉素(GA)在无核葡萄果实不同组织发育过程中的作用。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄(Rosario Bianco)为试材,利用miR-RACE和PCR技术克隆鉴定VvmiR159a/b/c的成熟体及前体序列;通过PsRNATarget软件预测VvmiR159s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行系统进化及保守结构域分析;通过启动子作用元件分析预测VvmiR159s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证VvmiR159s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA在葡萄果实不同组织发育过程中的时空表达模式。【结果】从‘白罗莎里奥’葡萄果实中克隆获得VvmiR159a/b/c的成熟体序列、前体序列并折叠发夹结构。鉴定到VvmiR159s的四条靶基因(VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15、VvGRAS-l),其中VvmiR159s与VvGAMYB匹配程度最高,与VvAIX15匹配程度最低。靶基因系统进化及保守结构域分析显示,4条靶基因与其他物种同源基因具有较高同源性。VvmiR159s前体基因及其靶基因启动子的激素响应元件均以赤霉素和水杨酸响应元件为主,表明其可能主要通过应答这两种激素参与调控葡萄的生长发育过程。VvmiR159s在不同组织中的表达具有时空特异性,其中VvmiR159c在果皮和果肉中的表达趋势不同,在果皮中VvmiR159a/b/c与VvAIX15的表达水平呈负相关;而在果肉中,VvmiR159a/b与VvGAMYB和VvAIX15的表达模式相反。此外,在葡萄果皮、果肉中GA处理可显著下调VvmiR159a/c的表达,但却在幼果果肉中上调VvmiR159b的表达。表明葡萄miR159家族成员在果实不同组织中通过不同模式应答GA信号参与果实发育的调控。【结论】葡萄miR159家族含有VvmiR159a/b/c 3个成员;3个成员均可切割VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15及VvGRAS-l 4个靶基因;VvmiR159a/b/c及其4个靶基因可能以不同的GA应答模式参与调控葡萄果皮与果肉的发育。

盐度是影响刺参(Apostichopus japonicas)生长发育最重要的环境因子之一,而microRNAs(miRNAs)可通过与靶基因的m RNA特异性结合,实现对其靶基因的表达调控。为探究Aja-mi R-22和Aja-mi R-27及对应的两个靶基因在刺参低盐海水胁迫下的表达情况,本实验将刺参放入盐度18低盐海水中进行胁迫,取盐度胁迫后的3 h、6 h、12h、24 h、48 h和72 h不同时间点和正常盐度海水中刺参的体腔液,提取RNA和miRNA,利用qRT-PCR技术进行表达分析。结果表明Aja-mi R-22和Aja-mi R-27这两个mi RNA在盐度胁迫后各时段均呈现出上调表达趋势,且都在胁迫后3h达到最大值,分别为对照组的36倍和16倍。Aja-mi R-22和Aja-mi R-27在胁迫后各个表达量都均高于对照组,其中Aja-miR-22在胁迫后3 h、48 h与对照组差异极显著(P