LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表

PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。

用ＲＴ－ＰＣＲ从感染番茄环纹斑点病毒（ＴｏｍａＴｏ ｚｏｎａＴｅ ｓＰｏＴ ｖｉＲｕｓ，Ｔｚｓｖ）的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白ｎｓｓ基因，将ｎｓｓ基因构建到原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ ａ中，获得原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ａ－ｎｓｓ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），用ｉＰＴＧ诱导表达。ｓＤｓＰａＧｅ电泳分析显示，高效诱导表达了５７ｋ Ｄａ融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔，获得多抗血清。间接ｅＬｉｓａ测定多抗血清的效价为１／８１９２。用制备好的抗血清对Ｔｚｓｖ感病病样进行ＷｅｓＴｅＲｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ检测，能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于Ｔｚｓｖ的检测，并为进一步研究ｎｓｓ功．．．

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功...

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清。ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断。

提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于探究自噬基因ATG8的生物学功能。用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coliRosetta-gami B(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后利用Western Blotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异性。ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础。

利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血...

叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(+)上,将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS-PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E.coli中获得了高效表达。用Ni-NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West-b...

从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1 mmol/L IPTG、37℃、4 h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6 h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克...

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

【目的】类毒素过敏原蛋白(VAPs)是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。【方法】本研究利用聚合酶链式反应(PCR)扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。【结果】松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP_1和Bx-VAP_2基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP_3和Bx-VAP_4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21～31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体antiVAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP_4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,BxVAP_1潜在的优势B细胞抗原表位较多。【结论】重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3效价高,特异性良好,Bx-VAP_1具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...

【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...