【目的】开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志，对植物的生物量有重要的影响。紫花苜蓿作为世界上最重要的饲草作物之一，其产量和品质与开花时间密切相关。紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期，此时产量和品质最佳。前期获得一个与花期相关的编码基因HMG-Y，通过分析其结构及表达模式，探究其在开花调控途径中的功能，为揭示开花调节机制提供理论基础。【方法】同源克隆MsHMG-Y，并对其进行多序列比对和进化树分析。利用qRT-PCR检测不同组织和不同开花时期该基因的表达水平；分析MsHMG-Y受光照、赤霉素（GA3）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的表达模式；观察过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的表型，并分析开花促进因子与抑制因子的表达水平。【结果】MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y相似性最高，亲缘关系最近。组织特异性分析显示，MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达，其中，在父本和母本中均为花中表达量最高，叶中表达量最低；在早花表型父本的初花期表达量最高，在晚花表型母本的花芽分化期相对表达量最高。光周期分析表明，延长光照到16 h后，MsHMG-Y表达水平下调，延长光照到28 h后，MsHMG-Y表达水平持续低于对照组，说明该基因受光诱导后下调表达。外施50μmol·L-1 GA3、100μmol·L-1 SA、100μmol·L-1 MeJA后，与对照组相比，MsHMG-Y表达水平均上调，其中，GA3诱导1 h时表达量最高，为对照的3.5倍；SA诱导6 h时表达量最高，为对照的24倍；MeJA诱导3 h时表达量最高，为对照的11倍，说明该基因受3种激素诱导。表型观察发现，与对照相比，过表达MsHMG-Y紫花苜蓿开花较晚，促进开花相关基因的表达水平均下调，抑制开花相关基因的表达水平均上调，其中，表达量变化显著的有促进开花基因MsPHYA、MsGI和MsFTa1，分别降低了4.9、3.9和2.8倍，抑制开花基因MsTEM1和MsSVP的表达量分别提高了2.5和1.9倍。【结论】MsHMG-Y受光周期及外源激素GA3、SA和MeJA的诱导表达。MsHMG-Y对延迟苜蓿开花的调控机制有重要作用。

【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...

以敖汉苜蓿 (Medicagosativa)为材料研究了新型植物生长调节剂DTA - 6对苜蓿叶片、茎杆中粗蛋白、氨基酸、必需氨基酸和含硫氨基酸含量的影响。研究表明DTA - 6处理后苜蓿叶片粗蛋白含量比对照增加了 39.2 % ,茎杆中粗蛋白比对照增加了 33.5 %。DTA - 6处理提高了叶片中含硫氨基酸和必需氨基酸总量 ,降低了茎杆中含硫氨基酸和必需氨基酸总量 ,而且调节作用的剂量效应明显。对DTA - 6的作用机理作了初步探讨

【目的】克隆紫花苜蓿(Medicago sativa L.)抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸...

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。目前在许多植物中已发现大量的bZIP转录因子,这些bZIP转录因子成员广泛参与种子贮藏基因的表达、植物的生长发育、光信号传导、病害防御、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等各种信号的反应。本研究首次从紫花苜蓿(Medicago sativa)全转录组水平鉴定出bZIP转录因子家族共包含138个基因,根据bZIP蛋白序列进行系统进化分析可以将其分为10类;对MsbZIP基因的系统进化分析表明该基因家族在分类上有很高的保守

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列...

【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L~(-1))和ABA(100μmol·L~(-1))处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。

叶黄素循环是植物应对环境胁迫进行热耗散的光保护途径之一，紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)是叶黄素循环脱环氧化过程的关键基因。本研究采用RACE技术首次克隆了云南逸散紫花苜蓿(Medicago sativa)的MsVDE基因，同时采用实时荧光定量分析干热胁迫下的MsVDE基因表达特征。结果表明，MsVDE全长1 678 bp,CDS编码区1 608 bp，编码535个氨基酸。氨基酸序列保守区域具有3个VDE基因的特征区，即N-端半胱氨酸富集区、脂质运载蛋白特征区和C-端谷氨酸富集区。进化树分析表明该基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) VDE基因的氨基酸序列亲缘关系最近。干热胁迫第4天和第8天时的MsVDE基因表达量分别比正常条件上调了2.13倍和1.97倍；喷洒二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol, DTT)溶液后MsVDE基因表达量平均下调了55%。本研究初步得出，云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因在调控叶黄素循环应对干热胁迫中起作用。

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的...

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）介导甘油脂质生物合成的起始步骤，在植物生长发育过程中起着关键作用。本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa）栽培品种‘中苜1号’为材料，采用RT-PCR技术克隆了MsGPAT11基因。通过生物信息学分析表明，紫花苜蓿MsGPAT11基因CDS全长为1 497 bp，编码498个氨基酸；蛋白质分子质量55.55 kDa，等电点为9.27；含有保守的酰基转移酶结构域，是典型的GPAT家族基因；系统进化树分析表明MsGPAT11蛋白与同属植物蒺藜苜蓿GPAT蛋白亲缘关系最近，且与拟南芥AtGPAT6归于同一亚家族。时空表达分析表明MsGPAT11具有明显的组织特异性，在花中具有极高的表达量。非生物胁迫表达分析表明MsGPAT11基因明显受到干旱胁迫（PEG6 000）、高盐胁迫（NaCl）、冷胁迫（4 ℃）的诱导；且在盐、旱胁迫9 h后，MsGPAT11基因表达量显著上升并出现峰值。推测该基因可能参与了紫花苜蓿旱、盐的非生物胁迫调控过程并发挥重要作用。综上所述，本研究可为今后进一步探讨MsGPAT11基因在逆境下的生物学功能提供理论参考。

【目的】探讨紫花苜蓿次生壁合成的基因网络调控变化和表达模式,确定一些关键候选基因和转录因子,为紫花苜蓿次生壁加厚调控网络的分子机制研究奠定基础。【方法】对‘中苜1号’紫花苜蓿分枝期(S1)、现蕾期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)的茎进行近红外光谱法测定次生壁主要物质含量和Illumina Hi SeqTM2500高通量转录组测序。以紫花苜蓿的近缘物种蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)基因组作为参考基因组进行序列比对并组装构建转录本。利用FPKM法计算基因表达量,以Fold change(差异表达倍数)≥2或≤0.5(表达上调或下调)、FDR(false discover rate)≤0.05为筛选条件,在3个相邻时期转录组比较组合中(S2VS S1,S3 VS S2,S4 VS S3)筛选差异表达基因。通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库对紫花苜蓿不同发育时期差异表达基因的功能和参与的代谢途径进行注释。【结果】共获得41 734个基因在紫花苜蓿不同发育时期的转录表达情况,27个功能注释与紫花苜蓿纤维素、木质素合成密切相关的基因差异表达,其变化趋势与纤维素和木质素含量测定结果基本一致,即随着生长发育时期的变化,表达水平逐渐提高。研究表明,初花期是紫花苜蓿次生壁合成调控的转折期,纤维素和木质素含量与其合成基因表达量在初花期均显著提高。MTR_2g016630(Ces)和MTR_7g103590(Ces A1)等纤维素合成酶基因表达水平在初花期显著上升,木质素合成途径中,MTR_1g064090(PAL1)、MTR_1g111240(C4H)和MTR_2g104960(CCR)基因表达量在初花期或盛花期相比分枝期上调表达倍数达到10倍以上。本研究中27个与植物生长发育相关的转录因子在紫花苜蓿不同发育时期差异性表达,其中NAC家族和MYB家族转录因子有18个,也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等转录因子。【结论】获得‘中苜1号’紫花苜蓿在4个生长发育时期茎的基因表达谱数据,共获得54个差异表达基因,其中稳定上调基因24个,稳定下调基因30个。这些基因很有可能参与紫花苜蓿次生壁的合成调控。

【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位...

【目的】探究灯盏花叶片数相关基因磷酸蛋白酶1（EbPP1）的功能，为揭示灯盏花叶片数目和开花时间分子机理奠定基础。【方法】从灯盏花叶片克隆EbPP1基因，将其构建至植物过表达载体RP101。用蘸花法侵染刚抽薹拟南芥植株进行异源表达，通过筛选获得若干株T_(1)、T_(2)、T_(3)代拟南芥阳性植株。最后统计T_(3)代阳性植株叶片数目和开花时间，通过实时荧光定量（RT-qPCR）检测EbPP1表达量，并测定拟南芥植株内源激素含量。【结果】成功克隆到全长EbPP1基因，并构建了该基因的重组过表达载体RP101-GFP-EbPP1。在拟南芥中实现了稳定的遗传转化，于T_(3)代中获得24株阳性EbPP1转基因植株，并对T_(3)代阳性植株进行实时荧光定量分析，RT-qPCR结果显示转基因拟南芥中EbPP1基因过量表达，其表达量从野生型的1.034增加至136.33；转基因拟南芥在表型上呈现出叶片数增多、开花时间延迟的特征；通过LC-MS定量测定植株内源激素含量显示，T_(3)代转基因拟南芥中吲哚-3-甲酸（ICA）和赤霉素24（GA24）等多种激素的含量明显高于野生型，其中生长素前体物质L-色氨酸（TRP）尤为显著，达到了野生型的3倍。【结论】本研究成功在拟南芥植株中异源表达EbPP1基因，与野生型相比，转基因拟南芥中叶片数增多，EbPP1基因表达量增高，内源激素含量升高。基于上述结果表明EbPP1可能通过调控植物激素水平，进而影响灯盏花叶片数目和开花时间。本研究为进一步解析灯盏花叶片数目发育相关机制和开花分子机理奠定基础，同时也为选育高品质灯盏花新品种提供一定的遗传基础。

为了探讨外源6-苄氨基嘌呤(6-BA)对紫花苜蓿(Medicago sativa)叶片光合作用、抗氧化系统及结荚率的调控作用,以新牧4号紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Xinmu No.4’)为试验材料,现蕾期叶面喷施10、20、30 mg·L~(-1)的6-BA,以喷等量清水为对照,研究外源6-BA对苜蓿盛花期叶片光合参数、荧光参数、抗氧化酶活性、渗透调节物质及结荚率的影响。结果表明,20 mg·L~(-1)的6-BA处理显著(P

【目的】为不同品种苜蓿亲缘关系的判断和最大限度地利用杂种优势提供理论依据。【方法】采用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记方法,利用NTSYS软件,对22个紫花苜蓿(Medicago sativaL.)品种的遗传距离进行聚类,并对其亲缘关系进行分析。【结果】供试苜蓿品种之间的遗传基础较广,22个随机引物共检出289条扩增片段,其中多态性条带占88.93%;平均每个引物扩增的DNA条带数为4~18条,其中多态性谱带为2~17条;品种间遗传距离的变异为0.135 6~0.361 1,平均遗传距离为0.209 5,其中变异最大的是WL252HQ和"阿尔冈金...