为揭示紫花苜蓿耐铝机理,根据已知的紫花苜蓿(Medicago sativa L)与铝胁迫相关的EST序列,运用RACE技术获得了紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白基因的全长cDNA,命名为MsALMT1,这一全长cDNA为1 638 bp,包含一个1 344 bp的最大开放阅读框,编码448个氨基酸,BLAST比对发现,MsALMT1编码的氨基酸序列与已经公布的铝激活苹果酸转运蛋白存在很高的同源性。对紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白进行亚细胞定位研究表明,在植物体内该蛋白位于细胞膜上。

【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...

以紫花苜蓿(Medicago sativa)不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本组合构建BSA分离群体,获得的F1代均表现为雄性可育,在大田种植了221株F2代群体单株,盛花期将花粉颗粒染色后,显微镜下观察统计出,不育的F2代株数为57,可育F2代株数164,并没有观察到半不育植株。将所有植株划分为可育和不育两组,并构建可育和不育DNA混池,混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品,以此对恢复基因定位。随机挑选160对已知的四倍体苜蓿SSR引物扩增基因池DNA,获得2个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上的所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153,遗传距离分别为19.0、20.9、44.6和72.1cM。

叶黄素循环是植物应对环境胁迫进行热耗散的光保护途径之一，紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)是叶黄素循环脱环氧化过程的关键基因。本研究采用RACE技术首次克隆了云南逸散紫花苜蓿(Medicago sativa)的MsVDE基因，同时采用实时荧光定量分析干热胁迫下的MsVDE基因表达特征。结果表明，MsVDE全长1 678 bp,CDS编码区1 608 bp，编码535个氨基酸。氨基酸序列保守区域具有3个VDE基因的特征区，即N-端半胱氨酸富集区、脂质运载蛋白特征区和C-端谷氨酸富集区。进化树分析表明该基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) VDE基因的氨基酸序列亲缘关系最近。干热胁迫第4天和第8天时的MsVDE基因表达量分别比正常条件上调了2.13倍和1.97倍；喷洒二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol, DTT)溶液后MsVDE基因表达量平均下调了55%。本研究初步得出，云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因在调控叶黄素循环应对干热胁迫中起作用。

【目的】克隆紫花苜蓿(Medicago sativa L.)抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸...

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的...

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）介导甘油脂质生物合成的起始步骤，在植物生长发育过程中起着关键作用。本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa）栽培品种‘中苜1号’为材料，采用RT-PCR技术克隆了MsGPAT11基因。通过生物信息学分析表明，紫花苜蓿MsGPAT11基因CDS全长为1 497 bp，编码498个氨基酸；蛋白质分子质量55.55 kDa，等电点为9.27；含有保守的酰基转移酶结构域，是典型的GPAT家族基因；系统进化树分析表明MsGPAT11蛋白与同属植物蒺藜苜蓿GPAT蛋白亲缘关系最近，且与拟南芥AtGPAT6归于同一亚家族。时空表达分析表明MsGPAT11具有明显的组织特异性，在花中具有极高的表达量。非生物胁迫表达分析表明MsGPAT11基因明显受到干旱胁迫（PEG6 000）、高盐胁迫（NaCl）、冷胁迫（4 ℃）的诱导；且在盐、旱胁迫9 h后，MsGPAT11基因表达量显著上升并出现峰值。推测该基因可能参与了紫花苜蓿旱、盐的非生物胁迫调控过程并发挥重要作用。综上所述，本研究可为今后进一步探讨MsGPAT11基因在逆境下的生物学功能提供理论参考。

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。

【目的】DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。

采用基因文库筛选方法,克隆了鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA,对其序列进行了分析,同时利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测了不同外界因子刺激下鲤外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示,用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明,该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体...

【目的】开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志，对植物的生物量有重要的影响。紫花苜蓿作为世界上最重要的饲草作物之一，其产量和品质与开花时间密切相关。紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期，此时产量和品质最佳。前期获得一个与花期相关的编码基因HMG-Y，通过分析其结构及表达模式，探究其在开花调控途径中的功能，为揭示开花调节机制提供理论基础。【方法】同源克隆MsHMG-Y，并对其进行多序列比对和进化树分析。利用qRT-PCR检测不同组织和不同开花时期该基因的表达水平；分析MsHMG-Y受光照、赤霉素（GA3）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的表达模式；观察过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的表型，并分析开花促进因子与抑制因子的表达水平。【结果】MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y相似性最高，亲缘关系最近。组织特异性分析显示，MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达，其中，在父本和母本中均为花中表达量最高，叶中表达量最低；在早花表型父本的初花期表达量最高，在晚花表型母本的花芽分化期相对表达量最高。光周期分析表明，延长光照到16 h后，MsHMG-Y表达水平下调，延长光照到28 h后，MsHMG-Y表达水平持续低于对照组，说明该基因受光诱导后下调表达。外施50μmol·L-1 GA3、100μmol·L-1 SA、100μmol·L-1 MeJA后，与对照组相比，MsHMG-Y表达水平均上调，其中，GA3诱导1 h时表达量最高，为对照的3.5倍；SA诱导6 h时表达量最高，为对照的24倍；MeJA诱导3 h时表达量最高，为对照的11倍，说明该基因受3种激素诱导。表型观察发现，与对照相比，过表达MsHMG-Y紫花苜蓿开花较晚，促进开花相关基因的表达水平均下调，抑制开花相关基因的表达水平均上调，其中，表达量变化显著的有促进开花基因MsPHYA、MsGI和MsFTa1，分别降低了4.9、3.9和2.8倍，抑制开花基因MsTEM1和MsSVP的表达量分别提高了2.5和1.9倍。【结论】MsHMG-Y受光周期及外源激素GA3、SA和MeJA的诱导表达。MsHMG-Y对延迟苜蓿开花的调控机制有重要作用。

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列...

PA28α can activate the latent 20S proteasome together with PA28β,playing an important role in the processing of MHC class I antigen.PMSE1 gene encoding this activator has been characterized and documented in mammals,whereas,few reported among piscine.In the present study,two pairs of primer were des...

【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L~(-1))和ABA(100μmol·L~(-1))处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。

【目的】分枝是决定紫花苜蓿产量的重要影响因子，SPL家族基因是一类重要的转录因子，其成员参与多种植物的分枝（分蘖）发育过程。研究紫花苜蓿MsSPL17的生物学功能，鉴定MsSPL17在调控紫花苜蓿分枝发育中的作用，为紫花苜蓿高产生物育种提供重要参考。【方法】运用生物信息学方法分析MsSPL17序列，并构建系统进化树；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析MsSPL17在紫花苜蓿中的组织表达特异性；利用烟草瞬时表达系统确定MsSPL17蛋白的亚细胞定位；利用酵母系统检测MsSPL17的转录自激活活性；利用农杆菌介导转化的方法获得转基因紫花苜蓿并进行表型分析；利用转录组分析，筛选出在转基因株系中的差异表达基因，并验证用于后续研究。【结果】MsSPL17包含一个长度为1 011 bp的开放阅读框，编码由366个氨基酸构成的蛋白，属于SBP蛋白家族。系统进化分析表明，MsSPL17及其同源基因的进化与物种的分化高度相似，表明其是一个功能保守的基因。MsSPL17在紫花苜蓿分枝发育关键时期中的各组织包括茎、茎节、叶、顶端中均有表达，暗示该基因对紫花苜蓿分枝性状具有重要调控作用。亚细胞定位试验表明，MsSPL17蛋白定位于细胞核中。转录自激活试验表明，MsSPL17不具有自激活活性，可后续进行互作蛋白的筛选。MsSPL17转基因沉默株系出现分枝数和茎节数明显增多、节间长度缩短、营养品质升高的显著表型。【结论】成功克隆了紫花苜蓿MsSPL17，其在紫花苜蓿分枝发育关键组织中均有表达，它编码的蛋白定位于细胞核中且无转录自激活活性。获得具有多分枝性状的转基因株系，其产量方面出现分枝数显著增多等表型，品质方面粗蛋白含量提高。