【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位...

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列...

【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...

【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L~(-1))和ABA(100μmol·L~(-1))处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。

【目的】克隆紫花苜蓿(Medicago sativa L.)抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸...

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的...

转录因子可以调节众多下游基因的表达，在植物抗逆境中起重要的调节作用。为了解析转录因子在南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制，以南方型紫花苜蓿Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ‘ＭｉｌｌｅｎｎｉｕＭ’为材料，以正常培养（Ｗｔ＿ｃｋ１）和氯化钠（盐）胁迫（Ｗｔ＿ｎ１）条件下的２个样品根系进行转录组分析，鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子基因。同时，随机挑选４个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ（３次重复），验证转录组测序技术（Ｒｎａ－ｓｅｑ）结果的可靠性。结果表明：紫花苜蓿根系在２５０ ＭＭｏｌ·ｌ－１氯化钠胁迫下７２ ｈ，共检测到３１ ９０７个基因表达量发生了改变，表达量差异达到．．．

【目的】挖掘、分析响应干旱诱导的MYB转录因子的功能,为棉花抗旱研究和育种提供参考。【方法】以已知受干旱诱导表达的Gb MYB5为检索项,BLASTX检索NCBI的非冗余蛋白nr数据库中与Gb MYB5具有相似序列的棉花MYB转录因子,通过荧光定量PCR验证获得干旱应答相关的MYB转录因子Gh RAX3。将Gh RAX3-GFP融合蛋白表达载体通过农杆菌注射法在烟草叶片瞬时表达,观察亚细胞定位荧光信号。将棉花曲叶病毒CLCr V介导的基因沉默载体CLCr V﹕Gh RAX3通过农杆菌浸润法注射棉花子叶,荧光定量PCR检测棉花Gh RAX3表达水平,对Gh RAX3沉默的棉花植株进行干旱胁迫处理...

叶黄素循环是植物应对环境胁迫进行热耗散的光保护途径之一，紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)是叶黄素循环脱环氧化过程的关键基因。本研究采用RACE技术首次克隆了云南逸散紫花苜蓿(Medicago sativa)的MsVDE基因，同时采用实时荧光定量分析干热胁迫下的MsVDE基因表达特征。结果表明，MsVDE全长1 678 bp,CDS编码区1 608 bp，编码535个氨基酸。氨基酸序列保守区域具有3个VDE基因的特征区，即N-端半胱氨酸富集区、脂质运载蛋白特征区和C-端谷氨酸富集区。进化树分析表明该基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) VDE基因的氨基酸序列亲缘关系最近。干热胁迫第4天和第8天时的MsVDE基因表达量分别比正常条件上调了2.13倍和1.97倍；喷洒二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol, DTT)溶液后MsVDE基因表达量平均下调了55%。本研究初步得出，云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因在调控叶黄素循环应对干热胁迫中起作用。

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）介导甘油脂质生物合成的起始步骤，在植物生长发育过程中起着关键作用。本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa）栽培品种‘中苜1号’为材料，采用RT-PCR技术克隆了MsGPAT11基因。通过生物信息学分析表明，紫花苜蓿MsGPAT11基因CDS全长为1 497 bp，编码498个氨基酸；蛋白质分子质量55.55 kDa，等电点为9.27；含有保守的酰基转移酶结构域，是典型的GPAT家族基因；系统进化树分析表明MsGPAT11蛋白与同属植物蒺藜苜蓿GPAT蛋白亲缘关系最近，且与拟南芥AtGPAT6归于同一亚家族。时空表达分析表明MsGPAT11具有明显的组织特异性，在花中具有极高的表达量。非生物胁迫表达分析表明MsGPAT11基因明显受到干旱胁迫（PEG6 000）、高盐胁迫（NaCl）、冷胁迫（4 ℃）的诱导；且在盐、旱胁迫9 h后，MsGPAT11基因表达量显著上升并出现峰值。推测该基因可能参与了紫花苜蓿旱、盐的非生物胁迫调控过程并发挥重要作用。综上所述，本研究可为今后进一步探讨MsGPAT11基因在逆境下的生物学功能提供理论参考。

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过ＢｌＡＳＴ分析比对，从棉花ｅＳＴ数据库中获得１个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子ＧＴ－２亚家族，命名为ＧｈＧＴ－２。以棉花叶片总ｒＮＡ为模板，根据ｅＳＴ序列设计引物，利用ｒＴ－ＰＣｒ结合ｒＡＣｅ技术，获得ＧｈＧＴ－２的编码序列。使用ＭｅＧＡ５对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统．．．

以紫花苜蓿SANDITI无菌苗下胚轴、茎、叶3种不同外植体,在附加不同激素浓度的MS培养基上诱导愈伤组织。结果表明,SANDIT最佳外植体为下胚轴,最佳下胚轴愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5mg/L。15 d继代1次,或适当降低2,4-D浓度,提高6-BA或KT浓度,可以降低愈伤组织褐化率。愈伤组织在6-BA0.5 mg/L,NAA 0.1 mg/L,GA31.0 mg/L,YE 250 mg/L,CH 250 mg/L的MS培养基上,可获得较高的分化率。

【目的】分枝是决定紫花苜蓿产量的重要影响因子，SPL家族基因是一类重要的转录因子，其成员参与多种植物的分枝（分蘖）发育过程。研究紫花苜蓿MsSPL17的生物学功能，鉴定MsSPL17在调控紫花苜蓿分枝发育中的作用，为紫花苜蓿高产生物育种提供重要参考。【方法】运用生物信息学方法分析MsSPL17序列，并构建系统进化树；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析MsSPL17在紫花苜蓿中的组织表达特异性；利用烟草瞬时表达系统确定MsSPL17蛋白的亚细胞定位；利用酵母系统检测MsSPL17的转录自激活活性；利用农杆菌介导转化的方法获得转基因紫花苜蓿并进行表型分析；利用转录组分析，筛选出在转基因株系中的差异表达基因，并验证用于后续研究。【结果】MsSPL17包含一个长度为1 011 bp的开放阅读框，编码由366个氨基酸构成的蛋白，属于SBP蛋白家族。系统进化分析表明，MsSPL17及其同源基因的进化与物种的分化高度相似，表明其是一个功能保守的基因。MsSPL17在紫花苜蓿分枝发育关键时期中的各组织包括茎、茎节、叶、顶端中均有表达，暗示该基因对紫花苜蓿分枝性状具有重要调控作用。亚细胞定位试验表明，MsSPL17蛋白定位于细胞核中。转录自激活试验表明，MsSPL17不具有自激活活性，可后续进行互作蛋白的筛选。MsSPL17转基因沉默株系出现分枝数和茎节数明显增多、节间长度缩短、营养品质升高的显著表型。【结论】成功克隆了紫花苜蓿MsSPL17，其在紫花苜蓿分枝发育关键组织中均有表达，它编码的蛋白定位于细胞核中且无转录自激活活性。获得具有多分枝性状的转基因株系，其产量方面出现分枝数显著增多等表型，品质方面粗蛋白含量提高。

【目的】DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表