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[期刊] 中国农业科学
[作者]
辛燕花 肖招燕 尤琳烽 郭丽琼 林俊芳
【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因(ts)在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体:把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol·L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6mol·L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因(ts)的转化:在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
涂珺 朱平 程克棣
天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1 494 bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9.42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王威威 李德鑫 李秋娥 廖海 张富丽 周嘉裕
【目的】:克隆名贵药材暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)鲨烯合酶(Squalene synthase, SQS)基因的全长ORF序列(FuSQS),并对其进行生物信息学分析和不同组织表达水平分析。【方法】利用PCR方法,克隆得到FuSQS,利用生物信息学方法预测FuSQS蛋白的基本理化性质、保守结构域、二级及三级结构等蛋白特性,利用Clustal W和MEGA 7.0分别进行氨基酸序列对比和系统进化分析,通过Real-time PCR分析FuSQS在暗紫贝母不同组织的表达水平。【结果】FuSQS长度为1230 bp(GenBank登录号MW365404),编码1条长度为409个氨基酸残基的肽链,相对分子质量为46.84 kDa,等电点(pI)为6.33,含有法尼基焦磷酸结合口袋和Mg~(2+)结合位点等保守结构域。系统进化树表明FuSQS与油棕、宽瓣重楼、水稻、玉米等单子叶植物进化关系较近。Real-time PCR结果显示,FuSQS在不同组织中表达量有显著差异。【结论】FuSQS的克隆、生物信息学分析及其在鳞茎中的高表达特征,这为进一步研究FuSQS在暗紫贝母生物碱生物合成途径的调控机制提供科学依据。
关键词：
暗紫贝母 鲨烯合酶 基因克隆 表达分析
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
程飞飞 欧春青 姜淑苓 王斐 马力 李连文
中矮1号(Pyrus communis)是中国农业科学院果树研究所选育的梨优良矮化砧木,为研究其矮化机理,应用同源克隆的方法从中矮1号叶片总RNA中克隆赤霉素合成过程中的关键酶——内根-贝壳杉烯合酶(KS)基因的cDNA全长序列,并对该基因在不同梨品种中的表达进行分析。结果表明:基于苹果基因组序列设计的特异引物从中矮1号的总RNA中扩增出了1个编码框全长为2214 bp的cDNA序列,其编码737个氨基酸残基,推断分子量为83.63 kD,等电点为5.37。其氨基酸序列与报道的其他植物KS氨基酸序列的相似性为53.61%～72.63%,其中,与板栗(AEF32083.1)的相似性最高,其氨基酸...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
肖颖 赵冬 王刚
【目的】研究紫杉烯合成酶超表达对紫杉醇代谢的影响,以提高红豆杉属植物细胞中紫杉醇的含量。【方法】从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)愈伤组织提取总RNA,根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物,通过RT-PCR技术扩增出该酶5′端长度为1 201 bp和3′端长度为1 388 bp的两个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5′端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3′端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定。两片段与双元载体pCAMBIA1300-35S::GUS以T4 ...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
于寒颖 杨谦
不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX...
关键词：
基因表达 核盘菌 arom基因 大肠杆菌
[期刊] 华北农学报
[作者]
王丹丹 刘晓红 宫远航
为进一步研究SQS基因在鹿角灵芝三萜合成途径中的作用机制及茉莉酸甲酯(MeJA)对GaSQS基因的表达调控,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆鹿角灵芝鲨烯合酶基因GaSQS,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行数据分析,采用MeJA对GaSQS基因诱导表达。结果显示,该基因全长1 969 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 515 bp,编码504个氨基酸,分子量为58.2 ku,具有1个跨膜结构域和3个保守区,为无信号肽的亲水性蛋白;GaSQS蛋白二级结构包括α-螺旋(59.52%)、无规则卷曲(28.37%)、延伸链(8.53%)和β-转角(3.57%);系统进化分析显示,鹿角灵芝GaSQS蛋白与灵芝SQS蛋白(ABF57213.1)具较高的同源性(99%);String蛋白互作网络分析显示,GaSQS蛋白互作的蛋白质共有10个,均为三萜、甾醇等萜烯类生物合成过程的重要物质;qRT-PCR分析表明,鲨烯合酶(SQS)的表达量与产量在原基和子实体初期高于其他发育阶段;在不同浓度MeJA诱导下,SQS蛋白均能高效表达,在200μmol/L时达到峰值效果最佳。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈岳文 康信聪 熊兴耀 刘东波
为验证Lacc1基因的功能,揭示灵芝漆酶基因及其启动子结构与其转录表达的内在关系,预测了Lacc1的氨基酸序列结构及灵芝漆酶注释基因Lacc1的上游启动子区域,研究已测序的菌株——灵芝P9在Cu2+诱导条件下漆酶基因Lacc1的表达情况。Protein Blast分析结果表明,Lacc1含有3个铜氧化酶(Cu-oxidase)保守结构域,与Polyporus ciliatus漆酶lcc3-3的相似性最高,为71%,并具有高度保守的漆酶特征序列L1-L4;亚细胞位置和信号肽预测结果表明,Lacc1含有信号肽,且为胞外分泌酶;Lacc1基因上游启动子区域包含1个TATAbox、3个金属响应元件(M...
[期刊] 华北农学报
[作者]
邓晓云 戴洪义 梁美霞
以柱型苹果茎尖为试材,采用同源克隆的方法克隆得到赤霉素合成代谢关键酶内根-贝壳杉烯合成酶的cDNA全长序列,命名为MdKS。MdKS的开放阅读框(ORF)全长2 214 bp,编码737个氨基酸。KS属于萜类合成酶亚家族,具有DDXXD保守结构域。氨基酸聚类分析表明,MdKS与梨同源性最高,为98%,其次是板栗,为73%;实时荧光定量PCR分析表明,在苹果的生长季节,MdKS基因在柱型和普通型苹果中均能表达。在苹果的生长初期,普通型苹果MdKS基因的表达量均明显高于柱型苹果,而在6月初,其表达量却略低于柱型苹果。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张前军 卢光琇
【目的】研究Borealin在小鼠早期胚胎及睾丸中的表达情况,初步探讨Borealin的生物学功能。【方法】利用体外合成RNA探针,采用全胚胎原位杂交检测Borealin基因在9.5～10.5日龄小鼠胚胎中的表达,免疫组化检测Borealin基因在成年小鼠睾丸中的表达,RT-PCR等方法检测Borealin基因在成年小鼠多组织中的表达。【结果】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎的头部和成年小鼠生精小管基底部细胞的部位有较强的表达,在睾丸、卵巢、肠以及眼睛组织中的表达量较其他组织高。【结论】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎头部及成年小鼠睾丸中均有特异性表达,可能参与了成...
[期刊] 华北农学报
[作者]
贺望兴 李文金 蒋咏梅 童忠飞 陈华玲 李延升 谢小群 李琛
为通过电子克隆得到灵芝LaeA基因序列，分析其基因序列信息，并初步探究其调控功能。采用电子克隆的方法，以已知桔青霉的LaeA蛋白序列为模板，在灵芝的EST数据库中进行序列相似性搜索比对(Blast),经序列拼接、序列验证和序列延伸等电子克隆方法获得灵芝LaeA基因的cDNA序列；采用生物信息学软件对LaeA基因编码蛋白质的基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构及进化关系等方面进行了预测和分析。结果表明，LaeA基因全长1 134 bp,编码378个氨基酸，蛋白分子质量为42.895 3 ku,存在于细胞质中，是亲水性蛋白；LaeA蛋白结构主要由47.88%无规则卷曲、33.33%α-螺旋和18.78%延伸链组成，有S-腺苷甲硫氨酸结合位点，属于AdoMet＿MTases超家族蛋白；系统进化分析结果显示，LaeA蛋白与云芝、污叉丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近；qRT-PCR结果表明，LaeA基因在灵芝细胞液体静置培养过程中的表达量显著高于振荡培养方式。推测LaeA蛋白作为1种甲基转移酶蛋白，通过参与组蛋白的甲基化修饰，进而影响基因簇的表达水平。
关键词：
灵芝 LaeA 电子克隆 生物信息学
[期刊] 华北农学报
[作者]
章文贤 蒋咏梅 贺望兴 郭文燕 黄晓菊 郑素云
通过电子克隆技术,获得14-3-3基因的cDNA序列全长,并采用生物信息学方法,借助电子计算机和相关的生物信息学软件,对该基因编码蛋白从基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜区结构、信号肽、高级结构及系统发育树分析等进行了预测和分析。该cDNA编码蛋白由257个氨基酸组成,相对分子质量为29.014 5 kDa,亲水性和疏水性比较平衡,定位于细胞质,不存在信号肽,无跨膜螺旋区,且二级结构由6.23%无规则卷曲,66.54%α-螺旋和27.24%延伸链组成。同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列与污叉丝孔菌、双孢菇和木耳等蘑菇类高等真菌中的14-3-3基因所编码的氨基酸序列高度同源。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张守涛 史婧 李楠 郭蔼光
根据蛇毒纤溶酶(A lfim eprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其分别连接在融合标签N usA,T h ioredox-in,Skp,H is T ag和信号肽pe lB的C端,构建成了多种ALF表达载体p43-A lf,p25-A lf,p32-A lf,p15-A lf和pSkp-A lf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD-PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603 bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp-A lf表达量最高...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李世军 尹宝颖 李佳 李中勇 张学英 徐继忠
苹果早熟品种果实易软化是影响其在生产中推广的重要原因,阐明其果实软化机理对于延长果实贮藏期,保持其品质具有重要意义。以藤木1号、XU2-5为试材,分析了果实软化过程中果实硬度、乙烯释放速率、相关酶活性及相关基因表达的变化,结果表明,随着果实成熟,果实硬度下降,乙烯释放速率升高,藤木1号的乙烯释放速率显著高于XU2-5;两品种(系)的MdACS6基因相对表达量变化基本一致,前期基因相对表达量较低,之后相对表达量逐渐升高。随着果实成熟藤木1号果实的MdPG1基因相对表达量和酶活性变化趋势一致,均在盛花后100 d达最高,而XU2-5则表现为盛花后80～90 d基因相对表达量和酶活性变化趋势一致,在盛花后90 d基因相对表达量最高,酶活性则在盛花后100 d达最高。盛花后80～85 d两品种(系)的PE活性与MdPE基因相对表达量均呈升高趋势,此时酶活性达一高峰,盛花后90～100 d,两品种(系)的MdPE基因相对表达量下降,而PE活性逐渐升高;两品种(系)的LOX活性均呈现先降低后升高的趋势,最低点出现在盛花后85 d,XU2-5的MdLOX基因相对表达量变化则呈现先升高后降低的趋势,高峰出现在花后85 d,而藤木1号的MdLOX基因相对表达量呈逐渐升高趋势,最高值出现在花后100 d。综上所述,采取措施调控基因的表达可能可以有效调控果实软化。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
龚月生 刘锦妮 王晶 杨明明 袁新宇
【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时...
关键词：
β-半乳糖苷酶基因 大肠杆菌 酶学性质
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