为探索在干旱后复水条件下糜子抗旱种质的基因表达特点,寻找与其复水后快速恢复生长相关的基因,利用抑制消减杂交(Suppressive subtraction hybridization,SSH)技术,以糜子干旱后复水处理叶片的cDNA为tester,干旱胁迫处理叶片的cDNA为driver,构建了一个抑制消减杂交文库。在文库中随机选取100个克隆(插入片段≥250 bp)测序,所获序列去除载体、引物及接头序列后,利用NCBI的BLAST序列比对分析软件分别对GenBank的dbEST数据库和非冗余蛋白数据库进行序列比对分析。序列同源性分析显示,文库中序列的同源基因主要以与新陈代谢、能量代谢、转录...

【目的】通过比较转水通道蛋白基因Pt PIP1;3(Gen Bank登录号:MN795092 ptopip1.3)的84K杨与野生型植株的光合作用对干旱及复水的响应,分析该过程的限制因素,以期深入了解水通道蛋白PIP1在干旱胁迫及复水过程中对CO_2导度的调节作用及其对光合作用的影响。【方法】以杂交杨84K野生型及转Pt PIP1;3基因植株为研究对象,进行重度干旱胁迫(土壤含水量达到田间持水量的35%)及复水处理,测定气体交换及叶绿素荧光各个指标,计算叶肉导度(g_m)等参数,进而分析水通道蛋白在干旱条件及复水后对CO_2导度和光合作用的调节作用。【结果】转Pt PIP1;3基因84K杨在正常浇水下净光合速率(P_n)、气孔导度(g_s)和蒸腾速率(Tr)显著高于84K野生型。干旱胁迫至第6天,野生型和转基因植株光合作用都开始下降,且转基因植株光合作用下降速度更快,至第7天降到野生型同样的水平。干旱处理的第7～10天,转基因植株和野生型植株的g_s、g_m和P_n均显著低于各自对照(正常浇水植株),光化学淬灭(q_P)、光系统Ⅱ实际光化学效率(Ф_(PSⅡ))、电子传递速率(J_(flu))、最大羧化速率(V_(cmax))和最大电子传递速率(J_(max))也显著降低,此时2种植株的光合作用都主要受到叶肉导度的限制。在复水的3天过程中,转基因植株的光合作用恢复速度更快,而且叶绿素荧光参数能够恢复到正常水平,期间光合作用主要受到叶肉导度的限制;而野生型植株的光合参数以及叶绿素荧光参数都未完全恢复,其光合作用除了受到叶肉导度的限制外,还受到光合作用中生物化学过程的限制。【结论】叶肉导度是转水通道蛋白基因及野生型84K杨干旱胁迫和复水过程中光合作用的主要限制因素。在干旱胁迫后水通道蛋白基因过表达的转基因杨树光合作用恢复迅速,包括光系统Ⅱ性能的恢复,这有助于杨树适应自然界中经常发生的阶段性干旱胁迫。

甲状腺激素T3在鱼类胚后发育与变态发育过程中发挥着重要作用,甲状腺激素T4通过Ⅰ型甲状腺氨酸脱碘酶(Dio1)生成T3,因此,调查Dio1基因在胚后发育包括变态发育过程中原位表达谱,有助于理解T3在胚后发育中的具体作用。利用RNA整体原位杂交技术,发现Dio1主要在牙鲆肠道、鳃、肝、肌肉、鳍、眼睛周围等器官和组织表达,鳃、肠道、奇鳍中的Dio1原位表达谱有一定的规律性,尤其在生骨肌细胞向鳍褶中迁移、臀鳍和背鳍(包括冠状幼鳍)的鳍条和支鳍骨的发生过程中,Dio1可能通过影响这些组织器官的T3水平而发挥重要作用。

在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从叶锈菌侵染的小麦叶片中发现在接种后8 h表现高表达量的CDPK2-EST。CDPKs即钙离子依赖蛋白激酶,是植物细胞应对各种生物和非生物胁迫过程中承接Ca2+流变化的重要因素。为进一步研究CDPK2在小麦与叶锈菌互作过程中的表达特性,采用RT-PCR和Western-Blotting技术分别在mRNA水平和蛋白质水平对小麦受叶锈菌侵染后不同亲和性组合中CDPK2的表达谱进行了检测。结果表明,小麦CDPK2基因受叶锈菌侵染诱导,不亲和组合在接种后4 h无论在mRNA水平还是蛋白质水平该基因均表现上调表达,而转录水平的表达量在接种后16 h降至对...

通过荧光定量PCR(qR T-PCR)技术对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Myostatin(EsM STN)基因在不同组织及蜕皮阶段的表达情况进行了分析。结果显示:(1)EsM STN在蜕皮间期(C期)中华绒螯蟹肌肉组织中的基因表达水平最高,胸神经节和脑神经节中也有较高水平的表达,暗示EsM STN基因的功能并不局限于肌肉生长的调节。(2)在不同蜕皮阶段,肌肉中EsM STN的基因表达水平在蜕皮后期(AB期)最高,蜕皮前期(D期)最低,推测EsM STN可能正向调节中华绒螯蟹肌肉生长,参与肌肉组织蜕皮后的生长以及蜕皮前的萎缩过程;肝胰腺、上皮组织中EsM STN的最高基因...

【目的】研究干旱-复水的水分动态变化及品种遗传特性对小麦水孔蛋白基因PIP2表达的影响,揭示小麦生理抗旱性的分子机制。【方法】以抗旱性差异较大的2个小麦品种"陕合6号"(抗旱)和"郑引1号"(干旱敏感)为材料,于幼苗培养至8d时,采用渗透势为-0.4MPa的PEG-8000溶液模拟干旱胁迫处理,胁迫时间分别为0(对照),12,36,60h,胁迫60h后复水36h。运用半定量RT-PCR方法,研究从干旱胁迫到复水的整个过程中,水孔蛋白基因PIP2在2种小麦根系中的动态差异表达情况,以及根系水导、叶片相对含水量、游离脯氨酸含量和细胞膜相对透性的变化。【结果】正常水分条件下,"郑引1号"中PIP2的...

【目的】分析干旱处理下苹果HYL1基因（MdHYL1）在苹果中的表达情况，并初步分析过量表达MdHYL1转基因苹果根系的生长情况，以了解MdHYL1在干旱中的功能特性。【方法】从金冠苹果中克隆出MdHYL1基因，对其进行干旱下的表达分析、系统进化分析和组织特异性表达分析；利用Gateway技术构建植物过表达载体pGWB414-MdHYL1，通过根癌农杆菌介导法转化苹果无性系GL-3，经卡那霉素筛选，采用PCR和RT-qPCR技术鉴定阳性转基因株系，并对转基因株系的根系生长情况进行观测。【结果】MdHYL1

【目的】谷子是一种耐旱作物,通过二代测序技术获得大量的谷子萌发期响应干旱胁迫的差异基因,进而挖掘谷子萌发期抵御干旱的关键基因及其相关的分子机制。【方法】以晋谷45为材料,谷子萌发期分别用18%PEG-6000干旱胁迫(处理组)和蒸馏水(对照组)处理种子并测定1、10和18 h种子的SOD、POD和CAT活性。SOD活性用氮蓝四唑(NBT)法测定,POD活性用愈创木酚法测定,CAT活性用比色法测定;对萌发10和18 h种子的对照组和处理组构建c DNA文库并进行差异基因表达谱分析;利用Bowtie将reads比对到参考基因组,采用RSEM对bowtie的比对结果进行表达量估计;使用DESeq进行差异表达基因分析;利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO在线数据库对差异基因进行功能注释,挖掘调控谷子萌发的关键基因;利用q RT-PCR验证测序结果的可靠性。【结果】处理组的SOD活性整体比对照组高,而POD活性和CAT活性与之相反;随着萌发时间的变化,SOD活性在不断地增加,但CAT和POD活性逐渐减小。基因表达谱序列与所选参考基因组序列高度一致,基因表达呈现出高度不均一性。通过高通量测序最后获得35 470个基因,以RPKM≥0.01为筛选标准,对照样本中分别筛选出24 030和24 486个表达基因,PEG干旱胁迫处理10和18 h的样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因;差异表达基因分析表明,谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因,其中87和267个上调表达基因,369和278个下调表达基因;GO功能显著性富集分析表明,差异基因主要涉及代谢过程,细胞进程和响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因参与到苯丙烷代谢和植物激素信号转导过程;通过q RT-PCR对5个差异基因在干旱胁迫下种子萌发时的表达分析表明,其表达趋势与表达谱分析结果基本一致。【结论】差异表达基因广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程;Sn RK2和PAL可能在干旱胁迫下调节种子的萌发。

【目的】了解干旱胁迫下大豆幼苗根系的抗旱机制。【方法】利用基因芯片技术,分析在不同干旱胁迫时间下强抗旱品种晋豆23幼苗根部基因的表达情况。【结果】获得了61171个大豆根系基因的差异表达动态图谱。在不同干旱胁迫时间下根部基因的表达发生变化,3个时间点下,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。同时对杂交数据进行多种聚类分析。利用实时荧光定量PCR验证4个基因在干旱胁迫条件下的差异表达,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。【结论】初步建立了大豆幼苗根系干旱胁迫应答基因的动态表达谱,并通过其动态表达了解植物与逆境的互作机制,比较全面地获得了干旱胁迫应答基因,从而更完整地揭示了大豆干旱胁迫应答基...

【目的】前期已对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)7日龄工蜂中肠(Am7)、10日龄工蜂中肠(Am10)进行全转录组测序,本研究基于高质量的组学数据探究中肠发育过程中的差异基因表达谱及其调控网络,以期解析意蜂工蜂中肠发育的分子机理。【方法】根据FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)算法计算基因表达量,并以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。利用TargetFinder软件预测ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相关生物信息学软件,对全部DEG进行GO和KEGG数据库注释。筛选出与AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受体、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13条信号通路存在富集关系的DEG,以及与ame-miR-6001-3p存在靶向结合关系的DEG,通过Cytoscape软件构建调控网络将其富集关系与调控关系可视化。利用茎环反转录PCR(Stem loop RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差异表达情况。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有1 038个DEG,包括515个上调基因和523个下调基因。这些DEG涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等功能条目,并显著富集在氧化磷酸化、氨基糖与核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢等能量和物质代谢通路,表明工蜂中肠内存在旺盛细胞生命与新陈代谢活动。表达量聚类分析发现分别有20、18、15和14个DEG富集在AMPK信号通路、P13K-Akt信号通路、内吞作用和Hippo信号通路。57个DEG与P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13条与生长发育和免疫防御相关的信号通路存在富集关系,且1个DEG可与多条信号通路存在富集关系。调控网络分析结果显示,分别有54个上调基因和44个下调基因可被ame-miR-6001-3p靶向结合;上调基因富集在磷酸肌醇代谢、胰岛素信号通路、Hippo信号通路和谷胱甘肽代谢等43条代谢通路,而下调基因富集在Hippo信号通路、新陈代谢途径、谷胱甘肽代谢和花生四烯酸代谢等20条代谢通路。RT-qPCR结果显示随机挑选的6个DEG的表达量变化趋势与测序数据一致,证实了本研究中基因差异表达真实可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10内均真实表达,并在Am10中的相对表达量显著较低。【结论】对意蜂工蜂中肠发育过程的DEG表达谱和DEG与ame-miR-6001-3p之间的调控关系,以及DEG的潜在作用进行深入分析和探讨,发现DEG可参与TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各类信号通路进而影响中肠的生长发育和免疫防御,DEG可通过与显著下调表达的ame-miR-6001-3p形成复杂的调控网络参与意蜂工蜂中肠发育过程中胰岛素信号通路等多条代谢途径。

雌激素相关受体（ＥＲＲ）在甲壳动物蜕皮过程中可能起着重要的调节作用，但是尚不清楚该基因在三疣梭子蟹不同组织和不同蜕皮阶段的表达模式。本文采用荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术研究了三疣梭子蟹雌激素相关受体（ＰＴ ＥＲＲ）基因在不同组织和不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明，ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ在Ｃ期三疣梭子蟹的Ｙ器官和鳃中表达水平最高，其次眼柄和胃中表达水平也相对较高，在３种肌肉组织和三角膜中表达水平较低。在不同蜕皮阶段，１３种组织中的ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ表达水平均差异显著。Ｙ器官中ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ从ＡＢ期到Ｅ期呈显著上升趋势；胸神经节和眼柄中的ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ变化模式均为先上升．．．

[目的]鉴定葡萄miR396家族成员（VvmiR396s）及其靶基因VvGRF1，探究VvmiR396s-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396s及其靶基因，生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，RT-qPCR 检测VvmiR396s在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396s-VvGRF相关性差异。[结果]与‘魏可’葡萄相比，‘京可晶’葡萄花后28 d种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而前者种子正常发育。对VvmiR396a/b/c/d 的前体及其成熟体序列进行鉴定，VvmiR396a/b/c/d前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396a/b/c/d 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396s的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1/10是VvmiR396s的真实靶基因，且后者对前两者的裂解位点及频度分别为10~(th)(19/22、5/25)/11~(th )(2/22、2/25)和9~(th)(17/21、3/20)/11~(th)(2/21、1/20)；进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行了活体验证，并发现VvmiR396s对VvGRF1的裂解作用强于VvGRF10，故在此重点研究其对VvGRF1的作用。靶基因VvGRF1蛋白与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近，且不同物种的GRF1均含有QLQ、WRC两个结构域；VvMIR396s和VvGRF1的启动子上都有多种激素（生长素、赤霉素、脱落酸等）响应元件，说明其可能通过响应激素信号从而调控生长发育；定量结果发现，在‘京可晶’种子败育过程中，VvmiR396a/b/c/d的表达量逐渐升高，且在败育关键期（花后42 d）有最高表达，而VvGRF1呈现相反表达模式；而在有核品种‘魏可’种子发育中，VvmiR396s呈现下降的趋势，在花后42 d有最低表达，靶基因表现相反的表达模式，表明VvmiR396s可能介导VvGRF1正调控葡萄种子败育，而负调控种子的发育；进一步相关性分析发现，‘京可晶’种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高，表明VvmiR396b对VvGRF1具有最强的负调控作用，且VvmiR396b-VvGRF1可能是葡萄种子败育的主要调控模块。[结论]在假单性结实葡萄‘京可晶’中，鉴定到VvmiR396a/b/c/d 4个成员；VvmiR396b-VvGRF1可能是参与调控葡萄种胚败育的调控途径。

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达.克隆得到LEC1基因803 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU584089.2),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含222个氨基酸)与其他植物LEC1具有较高同源性...

Foxl2是叉头状转录因子(forkhead transcription factor， Fox)基因家族的重要成员之一，在卵巢发育和性别调控中发挥着重要作用。为探究Foxl2在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性腺发育中的表达调控模式，利用生物信息学方法分析了虾夷扇贝Foxl2的序列特征；采用半定量PCR(RT-PCR)检测了Foxl2在不同组织中的表达差异。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和原位杂交技术(ISH)揭示了Foxl2在性腺发育4个时期(增殖期、生长期、成熟期和排放期)的时空表达变化。结果显示，虾夷扇贝Foxl2序列包含Fox基因家族共有的FH结构域；多重序列比较分析显示，虾夷扇贝与栉孔扇贝(Chlamys farreri)、欧洲大扇贝(Pecten maximus)的相似性最高，分别为98%、96%。系统进化树分析显示，在不同物种以及进化的过程中，Foxl2基因具有较高的保守性。定量分析和原位杂交结果显示，原位杂交阳性信号主要定位在生殖细胞的细胞质中。在虾夷扇贝的鳃、肾、肝胰腺、精巢中，都可检测到少量Foxl2转录本的存在，在卵巢中表达量最高，且在卵巢成熟期达到最高值。随着性腺发育和精细胞的逐级分化，Foxl2的表达量呈下降趋势，这与原位杂交的结果一致。研究结果表明，Foxl2在虾夷扇贝卵巢发育中可能发挥重要作用，推测其是雌性虾夷扇贝性腺发育调控中的关键基因，可为今后阐明其在虾夷扇贝性别分化进程中的功能提供理论依据。