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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
肖红卫 郑新民 陈思怀 乔宪凤 谷习文 田永祥 张涌 魏庆信
为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率,将人膜反应性溶解抑制物(hCD59)基因与脂质体混合制成基因/脂质体复合物,分别采用睾丸注射法和基因脂质体复合物/精子共孵育法制备转人hCD59基因猪,其中睾丸注射法处理公猪1头,44 d后配母猪8头,7头受孕(受孕率87.5%),产仔73头,PCR阳性猪3头(阳性率4.3%);外源基因/精子共孵育法处理公猪4头,处理母猪4头,1头受孕(受孕率25%),产仔11头,PCR阳性猪1头(阳性率9%)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪,经PCR初步检测,其中4只仔猪为转基因阳性,阳性率4.8%。研究结果表明:通过精子介导法可以获得转基因猪。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
焦明霞 牟彦双 格日乐其木格 张琳琳 孔庆然 付海鹏 刘忠华
【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L-1的Cy-3标记DNA(Cy-3-DNA)在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后...
[期刊] 华北农学报
[作者]
侯仕农 高雪梅 闫强
精子因在授精中的独特作用而被认为是携带外源DNA的理想载体。以精子作为载体制备转基因动物技术以其操作简单、成本低廉、便于大量筛选等优点受到人们的高度重视。文章主要介绍了精子介导基因转移制备转基因动物的基本原理、发展过程、最新研究进展及目前存在的问题。
关键词：
精子介导 转基因 方法
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李莉 郑新民 魏庆信 魏雁
采用显微混合注射的方法制备转人MCP(膜辅因子蛋白)和CD59(膜反应性溶解抑制物)双基因小鼠,共注射478枚受精卵,移植于21只受体,其中14只受孕,8只受孕小鼠中途流产,从6只受孕小鼠获得18只仔鼠,经检测,其中9只仔鼠单基因阳性(50％),6只仔鼠双基因阳性(33.3％)。结果表明:通过显微混合注射的方法可以获得转人MCP和CD59双基因小鼠。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭战军 马毅 李三华 韩瑞发 李胜芝 孙光 乔宝民 马腾骧 陈永福
为探讨超急排斥反应(Hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(Delayed xenograft rejection,DXR)的分子调控机制,采用优化的精子介导法(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)对建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型进行了研究。结果表明,应用树枝状聚合物(Dendrimers)优化SMGT后,2细胞胚GFP+RFP的阳性率达到4.51%,同对照组相比差异极显著(P
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
池青 周鹏 刘香利 程绘绘 赵惠贤
【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5...
关键词：
小麦 基因枪法 共转化法 PYL5基因
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋成义 高波 吴晗 王霄燕 王升智 周辉云 陈国宏 毛九德
【目的】揭示若干精子抗原基因(SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E)在梅山公母猪生殖道及成熟精子中的mRNA时空表达规律。【方法】利用RT-PCR技术分析各基因在生殖道和精子中组织表达谱,利用半定量RT-PCR分析其在初生至150d梅山公猪睾丸中的发育性表达特性。【结果】5个基因在梅山公母猪生殖道组织中呈现不同的表达特性。其中SPAG1在睾丸中表达丰度最高,在精囊腺、前列腺、附睾体、子宫角和输卵管呈现中等丰度表达,而在附睾尾、子宫颈和卵巢的表达信号较弱。SPAG5在睾丸中表达丰度最高,在前列腺、附睾体和子宫颈中表达信号较弱。而SPAG6在睾丸中高丰度表达,在输卵管...
关键词：
猪 精子抗原 生殖道 精子 时空表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
阮小蕾 王加峰 李华平
将PCR检测呈阳性的T4代转复制酶(replicase,Rep)基因番木瓜植株在苗期接种番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)Ys株系,定期采取不同部位的叶片进行Northern blot分析。结果表明:接种PRSV之前,在植株的各部位均能检测到转基因完整的Rep mRNA,但接种后不同时间在接种叶以上部位陆续出现了Rep mRNA的降解;接种后30 d内,接种叶下部第1片叶上始终未出现Rep mRNA的降解;另外,在发生mRNA降解的叶片上都能相继检测到小分子干涉RNA(short interferring RNA,si RNA)的产生。这说明转基因番木瓜的抗...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
蔡伟光 习欠云 肖敏 关立增 孟繁明 束刚 朱晓彤 江青艳 吴珍芳 张永亮
【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为:100μL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子(109个/mL)给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件(100μL慢病毒原液(...
关键词：
慢病毒 精子介导转基因 转基因猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周鹏 池青 吕金洋 刘香利 赵惠贤
【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性...
关键词：
小麦 基因枪法 共转化法 KN2基因
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
闫学春 钟莎莎 徐鹏 邹曙明 孙效文
卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PC...
关键词：
Tgf2转座子 Fst1 鲤 转基因效率
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王海凤 韩冉 张东武 刘振华 赵惠贤
【目的】获得转玉米ZmalⅠ基因的安全转基因小麦植株,为研究玉米ZmalⅠ基因在增加小麦籽粒大小和粒质量方面的作用,以及利用基因工程提高小麦产量奠定基础。【方法】以陕农138为供试材料,绿色荧光蛋白基因(GFP)为安全标记基因,利用基因枪法,将由谷蛋白胚乳特异表达启动子启动的ZmalⅠ+GFP融合蛋白基因的过表达载体pGlu-exbessa::ZmalⅠ导入小麦中,并对转基因小麦进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击3 000个幼胚,获得再生植株59株,移栽至培养钵后成活52株,成活率为88.1%;利用载体上安全标记基因GFP的特异引物对成活的转化植株进行PCR检测,获得含有GFP基因的阳...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王新颖 文晓鹏 胡鹏
以贵州珍珠半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit为材料,采用根癌农杆菌介导法,探索了影响半夏遗传转化效率的主要因子。结果表明,卡那霉素的最佳筛选浓度是100 mg/L,侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对转化频率都有一定的影响。其中侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在60~100 mg/L时可以有效提高遗传转化效率。在此基础上辅以超声波处理5 min,可以有效提高叶柄转化的瞬时表达率。对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因ipt已经整合到半夏基因组中。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
辛颖 张涛 张优优 张智英
【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基...
关键词：
慢病毒 活体 精原干细胞 转基因小鼠
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑月茂 赵雪 贺小英 权富生 刘军 张涌
【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、D...
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