【目的】克隆苹果（Ｍａｌｕｓ×ｄｏＭｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒＢｏｘｙｋｉｎａｓｅ，ｐｅｐｃｋ）基因Ｍｄｐｃｋｓ，研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性，为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和ｒｔ－ｐｃｒ技术，克隆获得Ｍｄｐｃｋ１和Ｍｄｐｃｋ２全长ｃｄｎａ序列并进行生物信息学分析；克隆Ｍｄｐｃｋｓ的启动子序列，利用ｐｌａｎｔｃａｒｅ软件在线分析启动子上的顺式作用元件；采用实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｒｔ－ｐｃｒ）检测Ｍｄｐｃｋｓ在不同组织中的表达以及在水杨酸（ｓａ．．．

利用农杆菌介导的转化方法研究OsPK1过表达对水稻的影响。将CaMV 35S启动子驱动的OsPK1的全长CDS序列导入到日本晴基因组中。选择3个过表达转基因系作为代表进行鉴定和分析。结果显示,过表达植株在株高、分蘖数、穗长和千粒重四方面接近野生型水稻,结实率略下降,但每穗饱满种子数明显增加。通过定量RT-PCR分析,发现有4个代谢酶在过表达植株嫩叶中表达存在着上调或下调。用GC-MS方法检测糖含量,显示OsPK1过表达株系中葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖的含量与野生型差异不大。总之,对OsPK1过表达株系的鉴定,有助于更好了解OsPK1的功能,并且每穗饱满种子数明显增加具潜在的应用价值。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶。本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因。从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段...

研究了水温从17℃突变为27℃对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力及热休克蛋白(HSP70)表达的影响。主要结果如下:(1)温度突变后,凡纳滨对虾肝胰脏中己糖激酶活力逐渐增大,温度突变后3h达到最高,是温度突变前的2.54倍(P<0.05)。随后,对虾己糖激酶的活力逐渐下降,72h酶活力基本恢复到温度突变前的水平。(2)温度突变后1h,凡纳滨对虾丙酮酸激酶的活力降到最低,随后逐渐增大;6h达到最高,随后对虾丙酮酸激酶的活力逐渐下降并在72h恢复到温度突变前的水平。(3)温度突变0.5h后,凡纳滨对虾肌肉中HSP70的表达量迅速升高...

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和...

【目的】丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,具有重要的生理作用。本研究通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰(RNAi)技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能。【方法】基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性。然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72 h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNAi效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性。【结果】HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1 350、1 569、1 656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01。保守结构域预测表明3条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族。HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角。3条序列的寡聚物类型均为同源四聚体。系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。注射ds HaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK2后,仅HaTRE1-1表达量在48 h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调。与对照组相比,在ds HaPYK1-2组中48 h时可溶性海藻糖酶(TRE1)活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在ds HaPYK1-1或ds HaPYK2组中48 h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加,膜结合型海藻糖酶(TRE2)活性显著提高;在ds HaPYK2组48 h时,海藻糖含量显著减少,而糖原含量显著增加。【结论】异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源ds HaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同。

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C3型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）是Ｃ４植物的光合关键酶，１００ｍｇ／Ｌ除莠霉素Ａ对ＰＥＰＣ活性有完全的抑制作用，而对Ｃ３植物的光合关键酶１，５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲｕｂｉｓＣＯ）的活性却没有影响。

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个Si PEPC(Seita. 1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,Si PEPC(Seita. 1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和Na Cl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,Si PEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测Si PEPC(Seita. 1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。

【目的】克隆华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK的cDNA序列，分析该基因在华中樱‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况及其编码蛋白质的结构特征和理化性质，为进一步研究PcoPMK基因在华中樱萜烯类物质合成途径中的功能提供参考。【方法】参照近缘物种的PMK同源基因cDNA保守序列设计特异性引物，应用RT-PCR技术扩增PcoPMK基因的cDNA序列，并进行克隆测序，同时应用定量RT-PCR技术分析该基因在‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况。应用ORF Finder在线工具预测基因的开放阅读框及编码的蛋白质序列；分别应用ExPASy、SOPMA、Swiss model和CDD在线工具分析蛋白质的理化性质、二级、三级结构和功能结构域；分别应用DeepTMHMM、SINALP 4.0 Server和PredictProtein在线程序预测蛋白质的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位；应用MEGA7.0软件构建基因的系统进化树。【结果】华中樱PcoPMK基因开放阅读框序列大小为1 530 bp，编码509个氨基酸，GenBank登录号为OR373074。编码蛋白质的相对分子量为55.199 kD，理论等电点为5.68，属于亲水性的稳定蛋白，定位于细胞质。PcoPMK蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等代表性物种PMK同源蛋白的序列相似度较高，含有3个典型且保守的蛋白结构功能域和1个ATP结合位点，无跨膜螺旋和信号肽，属于非分泌蛋白。PcoPMK基因在华中樱‘YS01’盛开期花瓣中的相对表达量显著高于花蕾期和半开期（P <0.05），与同时期花瓣中萜烯类香气物质的含量变化规律一致。【结论】本研究成功克隆了华中樱PcoPMK基因，初步推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用，为进一步研究该基因的生物学功能提供了参考。

为了研究甲羟戊酸-5-磷酸激酶(PMK)在紫苏萜类物质生物合成代谢通路中的重要作用，对紫苏转录组数据进行分析，挖掘出紫苏PMK基因参考序列，采用基因克隆技术从紫苏中克隆了PMK基因，利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对紫苏PMK基因进行了分析。结果表明，紫苏PMK基因开放阅读框(ORF)全长为1 524 bp,编码507个氨基酸。生物信息学分析显示，PfPMK的分子质量为54.73 ku,等电点为5.20,为亲水蛋白；紫苏PfPMK氨基酸与SmPMK、SsPMK、SbPMK和PvPMK同源性较高，说明紫苏PfPMK蛋白在进化过程中保守性较强。亲缘关系分析显示，PfPMK与丹参和一串红的PMK亲缘关系很近，在线软件WoLF-PSORT预测PfPMK蛋白可能定位于质膜或内质网膜上。qRT-PCR结果表明，PfPMK基因在紫苏根、茎、叶中均有表达，在根中的表达量高于在叶和茎中的表达量；紫苏不同生长发育时期的qRT-PCR分析显示，PfPMK基因在9月中下旬表达量较高。首次从紫苏中克隆出PfPMK基因，生物信息学分析该基因属于甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因，参与了紫苏萜类物质的生物合成。

为了深入研究己糖激酶(HK)的同工酶HKⅡ调控线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放机理,通过RT-PCR技术和RACE技术,以克隆得到的肥城桃果实c DNA为模板,成功克隆得到HKⅡ基因全长,经原核表达和SDS-PAGE检测,体外构建原核表达载体pET-30a-HKⅡ,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;使用镍柱纯化法,得到纯化的重组蛋白。克隆得到HKⅡ基因共1 835 bp,其中编码区1 496 bp,共编码497个氨基酸。HKⅡ蛋白预测分子式为C2379H3846N652O717S17,原子

以湘苎3号为材料,采用RT–PCR克隆,获得苎麻香豆酸–3–羟化酶(Bn C3H)基因的开放阅读框(ORF)序列,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体p ET–22b中,将构建成功的重组子p ET–22b–C3H转入BL21并诱导表达。结果显示:Bn C3H基因ORF区大小为1 536 bp,编码511个氨基酸,推测蛋白相对分子质量为57 800,理论等电点为8.61,编码的蛋白质为亲水性蛋白质;重组子在IPTG浓度为1 mmol/L时,融合蛋白的表达量在诱导2 h后达到最高,经IPTG诱导和SDS–PAGE检测,获得的融合蛋白与预期蛋白相符。