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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
丛斌 张明珠 胡志凤 段立佳 王晓静 张统书 董辉
为克隆米蛾［ＣｏｒＣｙｒａ ＣｅｐｈａｌｏｎｉＣａ（Ｓｔａｉｎｔｏｎ）］β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，建立米蛾β－ａＣｔｉｎ基因实时荧光定量ｐＣｒ（ｑｒｔ－ｐＣｒ）方法，并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性，利用反转录ｐＣｒ（ｒｔ－ｐＣｒ）技术克隆获得米蛾β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，采用ＳｙＢｒ ＧｒｅｅｎⅠ染料法建立ｑｒｔ－ｐＣｒ方法，检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫４个虫态中β－ａＣｔｉｎ基因的表达量。获得了长为８２２Ｂｐ的米蛾β－ａＣｔｉｎ基因片段（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ａＣＣｅＳＳｉｏｎ：ｋＪ５９９５６９），编码２７３个氨基酸残基；荧光定量标准曲线的Ｃｔ值检测范围为１３～２８．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨雪清 张雅林
【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67b...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
霍棠 姜鸣 吕淑敏 张雅林
【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量...
[期刊] 华北农学报
[作者]
姚梦瑶 李娟 刘志刚 蔡大润 李晓荣 李波 杨洋 王子轩 王勇攀 陈勋基 耿洪伟 陈果
盐碱胁迫已成为制约我国农业生产的重要因素之一，探索农作物耐盐分子机理，对作物育种具有重要的理论价值和实际应用价值。旨在克隆玉米中的ZmMPI基因，转化玉米植株。首先通过qRT-PCR对盐碱溶液处理下植株中的ZmMPI表达量变化进行分析，之后利用DNAMAN软件对ZmMPI蛋白序列进行多重比较分析同时利用MEGA 7.0软件构建系统发生树，并利用一系列软件对ZmMPI进行生物信息学分析。最后利用分子克隆技术，成功克隆ZmMPI基因的编码序列，构建植物过表达载体并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米自交系B104,在基因组水平、转录水平以及蛋白质水平对过表达转基因植株鉴定，分析其表达量变化。结果表明，ZmMPI基因的表达量受盐碱胁迫后整体呈现出先上升后下调的趋势；ZmMPI蛋白序列比较结果相似率为64.15%,系统发生树显示，ZmMPI与玉米(小颖大刍草亚种) ABA34115.1同源性最高，该蛋白含有一个蛋白结构域Potato＿inhibit,有α螺旋结构、无规则卷曲结构和β转角结构，偏疏水性，预测潜在的磷酸化位点有10个；对获得的49个转化事件鉴定结果显示，其中有13个过表达转基因株系中的ZmMPI基因在基因组水平能正常表达，有10个过表达转基因株系中的ZmMPI基因能正常转录、翻译。最终获得10个能够正常转录翻译的过表达转基因株系，为进一步探究ZmMPI基因响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。
[期刊] 草业科学
[作者]
郭欢 崔彦农 吴凡 张乐 许香玉 包爱科
在研究植物功能基因表达模式中肌动蛋白(Actin)编码基因是最常用的内参基因之一。本研究根据藜科植物Actin基因编码区保守序列设计一对简并引物,以盐生植物四翅滨藜(Atriplex canescens)4周龄幼苗叶片的总RNA为模板,采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法扩增出Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,所得阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明,该基因片段长度为598bp,编码198个氨基酸;该序列与Genbank中登录的
[期刊] 水产学报
[作者]
施志仪 程千千 宋佳坤 轩兴荣
为了研究Sox9基因在西伯利亚鲟侧线神经发育过程当中所起的调控作用,本研究利用RT-PCR和RACE方法获得了西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆Sox9cDNA全长为1409bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1083bp,5′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)19bp和3′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)307bp。1083bp的ORF共编码360个氨基酸,相对分子质量为41221.7U。序列分析表明,其与施氏鲟的亲缘关系较近,其次是斑马鱼。经实时荧光定量PCR技术对西伯利亚鲟S...
[期刊] 水产学报
[作者]
董晓丽 陈松林 季相山
同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘春 李凯彬 王芳 聂湘平 吴淑勤
本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法。根据已发表的底(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%。在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白。表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后...
关键词：
剑尾鱼 卵黄蛋白原 原核表达 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
魏广莲 徐钢春 顾若波 杜富宽 徐跑
利用RT-PCR和RACE技术获得刀鲚(Coilia nasus)Δ6脂肪酸去饱和酶(Δ6 fatty acyl desaturase,FAD6)的全长cDNA序列2 032 bp,开放阅读框(ORF)为1 338 bp,编码445个氨基酸。其具有3个保守的组氨酸簇(HDXGH、HXXHH和QXXHH)、2个跨膜区和含亚铁血红素结合基序(HPGG)的细胞色素b5结构域等典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点。氨基酸同源性分析显示,刀鲚FAD6与海鳗(Muraenesox cinereus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)等海水鱼类的相似性达75%~79%,而与淡水鱼类的相似性较低...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王冠华 李鑫 郭长宁 于建光 侯茜 辛文
【目的】对金纹细蛾Ｈｓｐ９０基因进行生物信息学和表达模式分析，为深入研究金纹细蛾ｐｒＨｓｐ９０与生长发育和抗逆行为的关系奠定基础。【方法】利用分子克隆技术获得金纹细蛾Ｈｓｐ９０基因片段，并对其进行生物信息学分析。同时利用ｒＴ－ｑｐＣｒ技术检测Ｈｓｐ９０在金纹细蛾不同组织、不同生长发育阶段和高温胁迫后的表达情况。【结果】获得了金纹细蛾Ｈｓｐ９０基因的一条长度为９４２ｂｐ的片段序列，命名为ｐｒＨｓｐ９０，登录号为Ｋｐ６７１６００。序列分析显示，其对应的氨基酸序列与其他昆虫的相似性很高，与棉铃虫（ＡＤｐ３７７１０．１）、斜纹夜蛾（ＡＤＫ５５５１６．１）、烟夜蛾（ＡＤＭ２６７４２．１）等鳞翅目昆虫的同．．．
关键词：
金纹细蛾 热激蛋白 生长发育 高温胁迫
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
董宏平 彭建令 余晓江 赵静 王颖 董汉松
建立了从不同植物中克隆抗病性信号传导调控基因及检测其表达的方法 ,并优化了相关条件。用RT PCR和PCR方法从拟南芥、烟草、番茄、中华鳖中克隆了 7个信号传导通路中 18个调控基因的cDNA和DNA序列 ,它们分别是 :抗病基因Pto介导的蛋白激酶级联中的Pti4、Pti5和Pti6 ,细胞编程死亡通路中的Hin1和hsr2 0 3,水杨酸介导的系统性获得抗病性通路中的NPR1,乙烯信号通路中的ETR1、ERS1、CTR1、EIN2和ERF1,茉莉酸信号通路中的COI1,核黄素信号通路中的RFBP和LR ,脱落酸信号通路中的ABF3、ABF4和ABH1,以及调控不同信号通路的通调基因NDR1...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈善真 李春玲 贾爱卿 王贵平
【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张洪波 杨宏军 葛利江 何洪彬 杨少华 王长法 高运东 仲跻峰
【目的】克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性。【方法】用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其血浆凝固效价。【结果】扩增出了2 106 bp的Coa基因,其包含1个完整的开放阅读框,编码含701个氨基酸的成熟多肽;IPTG诱导后该基因表达的融合蛋白分子质量为100 ku,目的蛋白产量占菌体总蛋白的13%;纯化的重组蛋白含量为0.047 mg/mL,其对兔血浆凝固效价为0....
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 陈如敬 江斌 王隆柏 魏宏 吴学敏 庄向生 周伦江
采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Opp A作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0μg·孔-1,于37℃包被1 h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450 nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.
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