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[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐｒ、Ｔｃｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌ＣＧ１２０株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌Ｊ－１株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板（含Ｔｃ、ｃｆｚ和脱脂奶）上进行筛选，筛选出６株蛋白酶缺失株（ＥＣＰａｓｅ－），ＥＣＰａｓｅ－菌株其生长速度，对正常鲫血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产霞明显降低。与亲本Ｊ－１株相比，突变株致病力降低，对鲫的半数致死量大于１０~８（Ｊ－１株对鲫的半数致死量为５×１０~３）。用ＥＣＰａｓｅ－突变株 ＭＪ－１株的１８ｈ培养物（５ ×１０~６ＣＦＵ）接种健康鲫，不产生亲本 Ｊ－１株引起的病变及死亡。用ＭＪ－１活菌免疫鲫，在第５周产生...
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 Tn916诱变
[期刊] 中国水产科学
[作者]
蒋蔚 刘永杰 陆承平
以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%~95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
范红结 陈怀青 姚火春 陆承平
将嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）Ｊ－１菌株第５代［Ｊ－１（５）］在产毒素培养基上连续传代至第３５代［Ｊ－１（３５）］，并分别检测Ｊ－１（６）和Ｊ－１（３５）的生化特性。另取Ｊ－１（６）、Ｊ－１（１５）、Ｊ－１（２５）和Ｊ－１（３５）分别制备嗜水气单胞菌灭活疫苗，用其分别免疫鲫鱼，之后用Ａｈ强毒攻击；同时用Ｊ－１（６）经腹腔注射或浸泡各免疫组鲫鱼，测其最低免疫剂量。结果显示，从第５代传至３５代，Ａｈ菌株的培养特性和免疫原性没有显著差异；腹腔免疫和浸泡免疫的最低有效剂量分别为１×１０７ｃｆｕ／尾和５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ。表明ＡｈＪ－１株可作为理想的疫苗生产株。
关键词：
嗜水气单胞菌 免疫原性 生化特性 稳定性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭松林 冯建军 陆盼盼 曹伟棋 赵金平
采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王 玉 冯建军 郭松林 林 鹏
在构建鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联外膜蛋白重组表达载体的基础上，采用不同的诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对重组表达载体的表达条件进行探讨。结果表明，不同诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对该载体的表达无明显影响。在菌液浓度 D600nm=0.8时，采用0.25 mmol/L的 IPTG经16℃诱导培养过夜后表达。表达产物采用KTApurifier-100 蛋白质纯化仪，结合His标签柱亲和层析后获得分子质量87.1 ku的高纯度蛋白。蛋白经透析复性后免疫鳗鲡以初步研究其免疫原性。结果表明，免疫后第28天，重组蛋白不同剂量注射组的...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
郝贵杰 沈锦玉 潘晓艺 尹文林 曹铮
胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郑津辉
为获得性状稳定、高产的碱性蛋白酶菌株,采用平板诱变法对产碱性蛋白酶菌株进行诱变处理。结果表明,采用牛奶平板法及Folin测酶活法从鸡粪土样获得产碱性蛋白酶出发菌株。该菌株经亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力为出发菌株34,65倍的2个变异株。因此,利用亚硝基胍作为诱变剂可产生高产酶菌株。
关键词：
碱性蛋白酶 筛选 诱变育种
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟喜龙 刘永杰 陆承平
对嗜水气单胞菌产弹性蛋白酶条件进行如下优化:用单因素法优化了氮源、碳源等培养基成分及温度和初始pH值等培养条件;用三因素三水平的正交试验对氮源浓度、碳源浓度、盐离子浓度进行优化。结果发现:较低浓度的氮源、碳源有利于酶的产生,表面活性剂能明显提高酶的产量。嗜水气单胞菌产弹性蛋白酶的最佳条件:胰蛋白胨5 g.L-1,蔗糖5 g.L-1,NaCl 2.5 g.L-1,K2HPO42.0 g.L-1,Tween-80 1 g.L-1,初始pH为7.5,28℃培养48 h。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈怀青 陆承平
将含有转座子Tn5的自杀性质粒pZJ25,用滤膜接合法从大肠杆菌S 17株中转移到有S层的嗜水气单胞菌J-1株。通过卡那霉素抗性筛选出嗜水气单胞菌Tn 5转移接合体。用嗜水气单胞菌TF 7株S蛋白抗体作点印迹免疫酶分析,从转移接合体中检测到一株S蛋白阴性的菌株,命名为TM 6。经检测TM 6的生理生化特性与J-1株基本相同,也能产生HEC毒素和蛋白酶,但超薄切片中未见S层结构。用菌体的酸性甘氨酸抽提物作SDS-PAGE,缺少S蛋白相应条带。用J-1株S蛋白抗血清作免疫转印,亦为阴性结果。表明TM 6是一株S层缺失突变的嗜水气单胞菌。
关键词：
嗜水气单胞菌 S层 Tn5诱变
[期刊] 淡水渔业
[作者]
孟小亮 陈昌福 吴志新 罗宇良
将经福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、菌体脂多糖(LPS)和菌体外膜蛋白(OMP)作为免疫原,分别接种斑点叉尾(Ictalurus punctatus Rafinsque)后,通过测定受免鱼的凝集抗体效价,头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和用A.hydrophila活菌攻毒的方法,探讨了斑点叉尾对A.hydrophila的3种疫苗的免疫应答状况和对活菌攻毒的免疫保护效果。试验结果显示:对斑点叉尾经腹腔注射接种3种疫苗均能刺激受免鱼产生较强的免疫应答,3种疫苗的受免鱼均产生了特异性凝集抗体,接种F-Ah灭活菌苗的试验鱼最高,接种OMP疫苗的试验鱼其次,而...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
储卫华 陆承平
以提纯的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 (ECPase)注射异育银鲫 ,鲫鱼出现典型的由嗜水气单胞菌引起的败血症症状 :病鱼体表充血、出血 ,鳃苍白 ,腹部膨大 ,肛门红肿突出 ,腹腔内有红色的腹水 ,肠壁充血发炎 ;背部肌肉注射部位发生液化、糜烂 ,鳞片竖起。病鱼各组织器官都有病变 ,其中尤以肝、肾最为严重 :肝脏肿大 ,质地脆弱 ,肝细胞水肿 ,胞浆结构疏松 ;肾小体坏死以至解体 ,肾小管上皮细胞也发生病变。体外试验表明 ,正常鲫鱼血清中有某种成分能够抑制蛋白酶的活性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
储卫华 陆承平
对体外培养嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶 (ECPase)产生条件进行了优化。结果发现 ,其产量与碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH值等有关。蔗糖能促进蛋白酶的产生 ,NH4 + 抑制蛋白酶的产生。其最佳产酶条件为 :pH 7 5的0 0 2mol·L-1KC1,0 0 6mol·L-1K2 HPO4 ,5g·L-1的蔗糖和 5g·L-1的胰蛋白胨水 ,2 8℃ ,15 0r·min-1摇床培养 6 5h。在此条件下酶活性可达 2 0 8U·mL-1。
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 培养条件
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
关键词：
嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 克隆
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
马宏宇 李菁菁 祁高富 喻子牛 赵秀云
对1株产蛋白酶的枯草芽胞杆菌(Z5)进行化学诱变,筛选得到1株产较高酶活性、大分子质量蛋白酶的菌株。检测该蛋白酶对底物明胶的分解能力,发现该蛋白酶的分子质量约为100 ku,还原剂巯基乙醇对其活性的影响较大。在不同温度、不同pH值处理该蛋白酶后,用茚三酮法测定酶活性,发现该蛋白酶催化反应的最适pH为6,最适温度为50℃,并且该蛋白酶有较好的热稳定性,70℃处理10 min仍能保留50%左右的酶活性。由于此蛋白酶在分子质量及最适pH方面均不同于已报道过的枯草芽胞杆菌蛋白酶,推测其为一种新型的蛋白酶。
关键词：
枯草芽胞杆菌 蛋白酶 化学诱变 酶学性质
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