【目的】研究BaMV福州分离物BaMV-TMS1及其携带的卫星RNA(satBaMV)分离物satBaMV-TMS1的全基因组特征,明确其系统发育关系;对BaMV进行c DNA侵染性克隆构建方法的改进,为其反向遗传学体系的快速建立提供简便的方法。【方法】根据已报道的BaMV和satBaMV全长序列保守区分别设计2对和1对扩增引物,从感染BaMV的竹叶中扩增、克隆获得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全长序列,并进行序列特征分析和系统发育树构建。采用多片段无缝克隆方法将扩增得到的2个病毒DNA片

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29(MF139550)同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

以建兰花叶病毒(CyMV)南京分离物侵染本氏烟的叶片为材料,利用RT-PCR扩增CyMV基因组cDNA,并进行测序,得到全长序列(GenBank登录号:JQ860108),然后插入到pCass4-Rz载体中,构建CyMV侵染性克隆载体。序列分析表明,与已报道的石斛兰、蝴蝶兰、香草兰分离物序列同源性高达96%以上,并且具有相同的基因组结构;不同国家和地区的序列进化树分析表明,其与我国台湾地区的病毒分离物亲缘关系最近。侵染性克隆通过农杆菌侵染接种本氏烟,与CyMV分离物具有相同的症状,并可利用RT-PCR检测到其外壳蛋白基因,表明成功构建了具有生物活性的CyMV侵染性克隆。

通过RT PCR,获得了小麦黄花叶病毒罗田分离物28kD蛋白基因的cDNA克隆pUW28 10。序列分析结果表明,小麦黄花叶病毒不同分离物的28kD蛋白基因的核苷酸序列存在一定的差异:湖北罗田和河南潢川分离物在第326,327和336位较四川雅安、江苏扬州及日本分离物缺少3个核苷酸(nt),前两者核苷酸长度为762nt,后三者为765nt;不同分离物核苷酸序列同源性从92 1%到96 9%,相应的氨基酸序列同源性从89 8%到97 3%。

【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物,构建侵染性克隆。【方法】大田辣椒样品通过ELISA检测,结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析,初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒(CMV)Phy株系。以辣椒病毒粒子RNA为模板,采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体,并分别比较5种(DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522)感受态细胞的转化效率。体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆(pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3)成RNA分子(P1P2P3),分...

从我国北方地区呈现花叶症状的白草上分离得到1个白草花叶病毒分离物(AY642590,PenMV-B),测定了其RNA的核苷酸全序列。结果发现,该病毒分离物的RNA基因组全长共9 611个核苷酸,5′-末端和3′-末端的非翻译区序列分别为172和241个核苷酸,中间为9 198个核苷酸的开放读框,编码3 065个氨基酸,分子量约为349 575 Da;其多聚蛋白P3/6K1处的E/H蛋白切割位点序列与Potyvirus属其他病毒均不相同,为该病毒所仅有。预期的Potyvirus属病毒的一些重要的、功能性保守基序特征都存在于该病毒的基因组序列中。Potyvirus属病毒多聚蛋白氨基酸序列的系统进化...

从云南省弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝，植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ），在红花大金元品种中以ＴＭＶ普通株作对照进行致病力测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒ＲＮＡ云南强毒株系为模板，根据国内外研究结果自行设计、合成寡核苷酸引物，通过ＲＴ—ＰＣＲ体外扩增，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α克隆，获得了云南烟草５４ＫＤ（ＴＭＶ复制酶）全基因片段。顺序分析表明：该基因含１４２５个核苷酸，编码４７５个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，ＤＮＡ同源率为９９．０％，氨基酸同源率为９８．９％，与国内普通株比较，ＤＮＡ同源率为９９．１％，氨基酸同源率为９８．９％。

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ；在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板，根据国外研究结果，自行设计、合成寡核苷酸为引物，通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增，得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α上，并进行了序列分析。分析表明，该其因含４７７个核苷酸，编码１５９个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，核苷酸同源率为９８．１％，氨基酸同源率为９７．５％。获得了云南烟草ＴＭＶ外壳蛋白全基因片段。

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原。采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达。结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜。对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nak...

［目的］构建黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）侵染性克隆，利用RNA-Seq技术分析感染CGMMV甜瓜的转录组数据，为深入研究甜瓜对CGMMV的抗病机理奠定基础。［方法］提取感染CGMMV甜瓜叶片RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板将CGMMV全基因组分成3段分别克隆，利用同源重组法构建侵染性克隆pCB-CGMMV。再分别提取感染CGMMV甜瓜和健康甜瓜叶片总RNA送生物公司进行RNA-Seq分析，Solexa GA pipeline和SOAP软件处理数据得到Unigene。再利用GenBank和Swissprot软件对大于350 bp的Unigene进行基因功能注释，Blast2GO程序用于搜索Unigene的GO注释，WEGO软件用于GO功能分类，Inter-ProScan software程序用于COG分析，OmicShare Tools程序用于KEGG分析。［结果］pCB-CGMMV分别接种黄瓜、西瓜、甜瓜和本氏烟，植株叶片均出现明显花叶症状，RT-PCR和Western blot检测各植株系统叶，均能检测到CGMMV。进一步将感染CGMMV甜瓜和健康甜瓜叶片进行转录组分析，共筛选到1872个差异表达基因（DEGs），其中1431个DEGs上调表达，441个DEGs下调表达。GO、COG注释和KEGG通路分析表明，DEGs参与碳水化合物和脂质转运代谢、植物信号传导、MAPK级联反应以及植物-病原物互作等途径。为了验证RNA-Seq测序结果，采用qRT-PCR检测了9个基因的差异表达情况，发现与转录组数据结果基本一致。［结论］本研究成功构建了CGMMV安徽分离物侵染性克隆，分析了感染CGMMV甜瓜的转录组数据，发现感病甜瓜差异表达基因DEGs参与植物多种抗病生理代谢。

在北京延庆的番茄上分离到1株黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物CMV-YQ,该分离物在番茄上造成严重的蕨叶、矮化,在烟草上表现花叶、矮化和畸形,表现出很强的致病性。根据黄瓜花叶病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术对其CP基因片段进行了扩增并克隆,获得了含该基因全长657 bp的cDNA片段。序列测定与比较分析结果表明,北京地区造成番茄蕨叶的CMV分离物CP基因片段核酸序列与GenBank上CMV亚组Ⅰ其他分离物同源性高达90%～99%,属于CMV亚组Ⅰ。该分离物与分离于我国芭蕉的另一亚组Ⅰ分离物GB同源...

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染辣椒的黄瓜花叶病毒湖北分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:湖北省内不同辣椒主产区采集到的样品CP基因之间的核苷酸同源率高达98.2%~99.2%,与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源率分别为92.1%~96.5%和72.1%~78.1%,并且和亚组Ⅰ中的IB系列株系同源率更高。由此确认这4个CMV分离物属于亚组Ⅰ中的ⅠB成员。

【目的】获得大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)基因组RNA1的全长cDNA,进行序列分析,明确与国外报道株系间的亲缘关系和分类地位【。方法】以自然侵染BSMV-CH的大麦叶片中提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法获得BSMV-CH RNA1的全长cDNA,克隆到载体pMD18并测序,用DNAstar软件将获得的序列与GenBank登录的BSMVRNA1序列进行对比,分析各株系序列RNA1之间的同源性,构建系统发育树分析BSMV-CH与国外株系间的亲缘关系。【结果】BSMV-CH的RNA1全长为3795bp(GenBank注册号:AY789693),基因组RNA15′端有一个甲基化的帽...

【目的】探明采自云南和海南表现为黄化、皱缩等表型的花叶青木病毒种类。【方法】首先，利用转录组测序技术对来自云南省昆明市的花叶青木样品进行检测；然后，根据转录组测序结果，采用RT-PCR对采自云南省昆明市和海南省海口市的73份花叶青木样品开展转录组测序结果中发现的病毒种类检测验证，并扩增获得相关病毒基因片段，对这些病毒的基因序列进行比对分析。【结果】转录组测序结果发现，送测的花叶青木样品中含有蚕豆萎蔫病毒2号（broad bean wilt virus 2,BBWV2）、菜豆黄花叶病毒（bean yellow mosaic virus,BYMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）、豌豆耳突花叶病毒1号（pea enation mosaic virus 1,PEMV-1）和豌豆耳突花叶病毒2号（pea enation mosaic virus 2,PEMV-2）5种病毒的侵染。但随后对来自云南和海南的73份花叶青木样品的RT-PCR验证中，只检测到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2 4种病毒。其中，云南和海南的样品中均能检测到BBWV2，总检出率为11.0%；而BYMV、CMV和PEMV-2仅在云南的样品中被检测到，检出率分别为5.5%、1.4%和1.4%。从两地采集的花叶青木样品中既未发现PEMV-1的侵染，也未发现BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2的复合侵染。为了进一步分析BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花叶青木分离物与来自其他寄主植物相关病毒分离物的分子变异，选取检测到上述4种病毒的样品，分别对BBWV2、BYMV和CMV 3种病毒的cp及PEMV-2的RdRp序列进行扩增，并对扩增获得的BBWV2 490 nt的small cp(GenBank登录号：OQ137565、OQ137566)、BYMV 499 nt的cp核心区域（GenBank登录号：OQ137568）、CMV 880 nt的cp(GenBank登录号：OQ137567)和PEMV-2 800nt的RdRp核心区域序列（GenBank登录号：OQ137569）进行分析。序列比对分析结果表明，BBWV2云南与海南花叶青木分离物间存在85.9%的核苷酸序列一致性，二者与GenBank中其他BBWV2分离物分别存在79.8%—94.5%和80.2%—92.0%的核苷酸序列一致性；BYMV、CMV和PEMV-2云南花叶青木分离物与GenBank中相应病毒的核苷酸序列一致性分别为79.8%—99.0%、71.5%—99.4%和84.9%—98.0%。利用以上病毒相应基因核苷酸序列构建系统发育树，发现BBWV2云南和海南花叶青木分离物分别属于I组中的a亚组和b亚组；BYMV云南花叶青木分离物与伊朗（GenBank登录号：MN241051,MN241060）和伊拉克（GenBank登录号：JQ026005）蚕豆分离物具有较近的亲缘关系；CMV云南花叶青木分离物属于I组中的IB亚组，但与IB亚组的其他成员具有较远的亲缘关系；PEMV-2云南花叶青木分离物与云南豌豆分离物亲缘关系最近并聚为一组，但与其他分离物存在较远的亲缘关系。【结论】首次报道了花叶青木被病毒感染，同时也是BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2在花叶青木乃至桃叶珊瑚属植物上的首次报道，BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花叶青木分离物与来自其他植物的相关病毒分离物存在较大的分子变异。

【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一，严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类，探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性，为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品，提取样品总RNA，利用小RNA深度测序初步探明病毒种类，然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段，然后通过同源重组克隆到p CB301双元载体上，得到YoMV-GD分离物基因组全长序列，同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟，检验pCB301-YoMV-GD的侵染性，然后再注射接种萝卜和菜心，测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3(Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3)、萝卜黄病毒1(Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1)、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种；YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt，编码4个蛋白，分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP，与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高，为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近；构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟，引起严重的坏死、枯斑等症状，具有较强的侵染性；YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心，引起轻微的黄化和花叶等症状，致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV，且以复合侵染形式存在；YoMV遗传进化并没有明显的地域性；YoMV-GD对烟草致病力较强，而对萝卜和菜心致病力较弱。