本研究以转Bar基因稻谷外源基因片断(Bar,CaMV35s)为检测对象,应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法建立稻谷中转Bar基因稻谷成分的定量检测方法。分别设计两对内参基因(SPS,RBE4)引物和外源基因(Bar,CaMV35s)引物,应用RT-PCR法对混合稻谷中不同量转Bar基因稻谷(30%、20%、10%、5%、0.9%、0.5%)进行定量检测,检测结果分别为:1、SPS与Bar基因组34.22%、22.14%、11.36%、6.21%、0.74%、0.32%;2、RBE4与Bar基因组28.68%、17.26%、11.92%、6.24%、0.75%、0.35%;3、SPS与C...

【目的】硅在水稻生长发育过程中具有重要作用,本研究的主要目的在于通过QTL分析研究水稻茎秆和剑叶硅含量的遗传控制。【方法】以由244个株系组成的珍汕97B/密阳46重组自交系群体为材料,在2003和2004年应用两重复试验测定亲本和各株系的茎秆和剑叶硅含量,应用由240个标记组成的连锁图谱检测数量性状座位(QTL)。【结果】所分析的两个性状表现为典型的数量性状,并呈现出以基因型控制为主、基因型×环境互作和环境影响为辅的特点。经WindowsQTLCartographer2.0分析,检测到3个茎秆硅含量QTL、6个剑叶硅含量QTL和2对控制茎秆硅含量的QTL间互作,它们分布于1、3、5、6、7和...

以转基因水稻科丰6号不同含量的水稻种子为样品,对影响检测结果的主要前处理措施,包括样品研磨颗粒细度与DNA提取过程中样品CTAB裂解缓冲液温育时间等,进行分析筛选.结果表明,样品颗粒细度与CTAB缓冲液温育时间的不同处理组合对提取的DNA含量影响极显著,其中,样品颗粒细度>100目与CTAB缓冲液温育时间>8 h(过夜)处理的样品DNA提取效果与荧光PCR检测结果均最佳.采用最佳前处理组合,样品的主要转基因成分(Ca MV 35S、NOS、Cry1Ab)检出限从通常的转基因含量质量分数0.01%降到0.001%,使得水稻种子转基因成分荧光PCR检测灵敏度提高10倍,大幅度提高了检测结果的准确性...

以147份南方籼稻品种或组合的稻米为供试材料,利用偏最小二乘法(PLS),通过不同波长和不同预处方式建立稻米直链淀粉含量的近红外分析模型。结果表明:全谱段(950～1 650 nm)建模效果最好,其相关系数(R)、预测标准差(SEP)、校准标准差(SEC)分别为0.947 7,1.162 3、0.700 2;采用多元散射校正法(MSC)法对全谱图进行预处理的效果较好,优化后的模型相关系数(R)、预测标准差(SEP)、校准标准差(SEC)分别为0.981 9、0.100 9、0.6831,其相对分析误差(PRD)为3.6;将稻米直链淀粉含量的近红外光谱预测值与化学值进行配对T检验,P=0.356>0.05(置信区间为95%),表明近红外光谱法与化学分析法得到的检测结果无显著差异,即应用近红外光谱快速检测稻米直链淀粉含量是可行的。

根据苜蓿基因组ALDH基因和稳定表达Actin基因mRNA序列,设计3对引物。提取苜蓿总RNA,采用oligo dT18作为反转录引物,经反转录获得cDNA,通过优化反应体系及反应条件,建立以苜蓿Actin基因为内参对照,检测苜蓿乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)基因(a亚基和b亚基)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,苜蓿ALDH基因(a亚基和b亚基)和Actin基因扩增曲线和标准曲线显示其基因扩增效率均大于99.9%,熔解曲线分析表明3个基因的扩增产物为特异性单峰,其Tm分别为(86.4±0.2),(80.6±0.1)和(83.0±0.1)℃。该方...

根据Gen Bank上的基因序列,在保守区设定并合成特异性引物,选择β–actin作为内参基因,采用SYBR Green I染料法,进行熔解曲线分析和标准曲线的制作。熔解曲线表明,β–actin、IL–1β、IL–8的基因产物均为特异性产物,其Tm值分别为86、82.5和84℃;标准曲线表明,各基因Ct值的检测范围为12~32,扩增效率分别为96.3%,103.2%和102.6%,具有良好的线性关系,且r2均大于0.990;组内变异系数分别为0.14%~0.86%,0.18%~0.93%和0.13%~0.86%;用建立的方法检测健康建鲤头、肾组织中IL–1β、IL–8的表达情况,相对表达量分别...

【目的】探明9个抗稻瘟病基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m在水稻材料中的分布情况，分析不同基因型对稻瘟病的田间抗性水平。【方法】选择万州区甘宁镇、恩施市白果乡和湄潭县兴隆镇3个稻瘟病抗性鉴定基地，通过调查基地内水稻叶瘟和穗颈瘟的田间发病情况，筛选出抗病等级在中抗及以上的材料87份，以白果乡基地为取材点，选取供试材料的剑叶，提取DNA，利用PARMS SNP分型原理，检测9个抗稻瘟病基因在87份水稻材料中的分布情况。【结果】3个试验点的水稻材料叶瘟发病较轻，仅湄潭点有27.59%的材料表现为中感，其余材料均表现为中抗及以上；穗颈瘟发病相对较重，其中湄潭点发病最重，全部为中感及以上，有的甚至丧失抗性，恩施点次之，有21.84%的材料表现为中感，万州点最轻，全部表现为中抗及以上。9个抗稻瘟病基因的分布情况：含有Pi1基因的材料4份；含有Pib基因的材料53份，杂合基因的材料5份；含有Pi2基因的材料47份，杂合基因的材料9份；含有Pi5基因的材料72份，杂合基因的材料5份；Pi9和Pik基因0份；含有Pita基因的材料36份，杂合基因的材料8份；含有Pigm基因的材料14份，杂合基因的材料3份；含有Pik-m基因的材料21份。在所测定的9个抗稻瘟病基因中只有几份水稻材料为单基因分布，多数材料至少有2个聚合基因分布，最多的含有5个聚合基因，还有2份材料中未检测到这些基因。【结论】综合稻瘟病田间抗性鉴定和抗稻瘟病基因检测结果，明确了单一稻瘟病抗性基因和聚合基因的抗性都在减弱，因此，挖掘抗稻瘟病能力强的新基因、新材料是选育抗稻瘟病新品种的有效途径。

由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．

胚乳的直链淀粉含量是影响稻米品质的主要因素。直链淀粉含量在5%～15%之间的低直链淀粉水稻,具有米饭柔软、外观油润光泽、冷不回生、膨化性好等特点,不仅成为人们直接煮食的特优稻米,也是加工方便调理米饭、膨化食品和米类点心的上等原料。在概述水稻低直链淀粉含量突变体及其基因的主要类型、遗传规律、分子机理和育种利用现状的基础上,重点对功能糖组学时代的低直链淀粉含量水稻遗传育种的研究方向进行了探讨,提出今后应进一步加强低直链淀粉含量资源的筛选、鉴定和创新,探明低直链淀粉含量突变的分子机理,并加快Wx非等位的低直链淀粉含量基因的育种利用,选育复合型优质专用水稻品种。

【目的】明确陕西省主要水稻种质资源中香味基因的存在状况,为香型水稻育种提供依据。【方法】利用针对香味基因fgr开发的四引物扩增受阻突变体系PCR技术,对陕西省164份水稻种质资源的香味基因fgr进行检测。【结果】在164份供试水稻材料中,127份为非香材料,2份为香型纯合体,35份为杂合体。【结论】本试验检测结果真实可靠,所用四引物扩增变阻突变体系PCR可以作为香型水稻检测认定的有效方法;陕西省水稻种质资源中香味基因占有一定比例。

[目的]建立水稻叶鞘网斑病的快速PCR检测体系,为该病害的早期诊断提供技术支持。[方法]以水稻叶鞘网斑病病原菌帚梗柱孢霉(Cylindrocladium scoparium Morgan)DNA为模板,分别以factor 1-α(tef1)和β-tubulin gene两个保守性极强的特定区域序列作为检测靶标,针对C.scoparium设计了EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9两对特异性引物,建立了水稻叶鞘网斑病的双基因联合PCR检测技术。[结果]该体系的最佳退火温度为58℃,DNA灵敏度检测限达到550 fg·μL-1,病原菌可扩增出大小分别为272 bp和157 bp的2...

根据米香基因的测序结果,设计了4对引物,在0.8%琼脂糖上电泳检测Fgr基因。结果表明,该方法较好地检测粳稻和籼稻米香基因(Fgr),为大规模进行分子标记辅助育种提供有效手段。

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...