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[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏胜娟 昝林森 王洪宝 成功 季舒涵 王虹 付常振 姜碧杰
【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4序列与GenBank收录的一...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张琼 姜碧杰 成功 刘扬 昝林森
【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶...
关键词：
ADIG 腺病毒 同源重组 秦川牛
[期刊] 中国农业科学
[作者]
付常振 昝林森 王虹 成功 王洪宝 李耀坤 姜碧杰 高建斌 杨宁
【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区(coding sequence,CDS)序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并...
关键词：
牛 SREBP1 shRNA 重组腺病毒
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
余横伟 桂林生 胡言 昝林森
【目的】探索脂肪酸结合蛋白3(Fat acid binding proteins 3,FABP3)及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因对秦川牛肉用新品系肉用性状的影响,为秦川肉牛的选育提供理论基础。【方法】随机选择1824月龄健康的秦川肉牛571头,尾静脉采血10mL/头,提取血液DNA,PCR扩增FABP3及FABP4基因,检测其单核苷酸多态性(SNP)位点,并分析SNP位点基因型和单倍型组合对肉牛肉用性状(背膘厚、眼肌面积、肌间脂肪含量)的影响。【结果】测序发现,在FABP3基因第3个内含子上检测出1
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李守湖 范玉锋 高欣 李宝玉 吴鹏程 胡永浩 柳纪省
【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒（IHNV）G基因，构建其重组腺病毒载体，为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因，将G基因插入到腺病毒穿梭载体中，再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒质粒，通过PCR扩增及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装，获得带有目的基因的重组腺病毒，通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒，用Western-blot法检测糖蛋白的表
关键词：
传染性造血器官坏死症 G基因 腺病毒载体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄凯 林亚秋 朱江江 马洁琼 王永
【目的】为利用超表达手段进一步研究成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的影响。【方法】本试验通过构建p Ad Track-CMV-FGF1穿梭质粒,转入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得腺病毒超表达载体pAdEasy-FGF1,经Pac I酶切鉴定后转染293A细胞进行病毒的包装与扩繁,最后用包装的pAdEasy-FGF1感染山羊肌内前体脂肪细胞,检测感染前后FGF1的表达变化。【结果】成功构建了腺病毒超表达载体p AdEasyFGF1,并在293A细胞中成功包装,其感染山羊肌内前体脂肪细胞能显著上调FGF1 mRNA的表达水平。【结论】说明FGF1基因可以通过感染重组腺病毒表达载体pAdEasy-FGF1在山羊肌内前体脂肪细胞中实现超表达。
关键词：
山羊 成纤维细胞生长因子1 腺病毒
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王杰 奥旭东 李文斌 白海栋 岳永莉 于海泉
【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fab...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王杰 陈婷 沈清武
【目的】分析锌指蛋白转录因子15(KLF15)在小鼠各组织及C2C12细胞分化过程中的表达情况,构建KLF15的腺病毒超表达载体。【方法】采集小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌及培养的C2C12成肌细胞,提取不同分化时期(0,2,4d)的C2C12细胞及不同组织的RNA,检测KLF15的表达情况;过夜连接HindⅢ和XbaⅠ双酶切后的pAdTrack-CMV与KLF15真核表达质粒(pcDNA3.1-KLF15),获得pAdTrack-KLF15质粒。将该质粒经PmeⅠ线性化后转入BJ5183感受态细胞进行重组,构建pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体。将pAdEasy-KLF15质粒PacⅠ...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
任充华 张婷婷 杨涵江 王昕 陈知龙 张智英
【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造,依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体,将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到BJ5183细菌中进行重组,经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK293人胚肾细胞,培养7d后,收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液;反复扩增3次后,测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-...
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳永莉 于海泉
小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白（ＦＡＢＰ４）的启动子／增强子元件是脂肪组织特异性启动元件，为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果，首先以小鼠肝脏ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ克隆得到５．９ ｋＢ的ＦＡＢＰ４基因启动子片段，连入Ｐ ＭＤ１９－Ｔ载体后进行酶切及测序鉴定，经ＥＣｏ Ｔ ２２Ｉ酶切去除非核心启动子区后精简为２．３ ｋＢ的片段，通过ＳＡＣⅡ酶切将５．９ ｋＢ片段和２．３ ｋＢ片段的启动子连入红色荧光蛋白载体Ｐ ＤＳ－ＲＥＤ ２－１的多克隆位点，构建为表达质粒Ｐ ＭＦ５．９－ＲＥＤ和Ｐ ＭＦ２．３－ＲＥＤ，利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞，２４ ｈ后实时定量ＰＣＲ检测．．．
关键词：
小鼠FABP4启动子 载体构建 牛体细胞
[期刊] 海洋渔业
[作者]
李守湖 张雪青 石建高
为克隆传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）G基因和传染性胰腺坏死病病毒（IPNV）VP2基因，并构建其重组腺病毒载体。利用PCR方法分别扩增出IHNV G基因和IPNV VP2基因，通过多基因片段同源重组技术将IHNV G基因和IPNV VP2基因克隆到Pad-Track-CMV载体，经过线性化后与PAd-easy-1载体在BJ5183菌体内同源重组，构建出重组腺病毒质粒，经PCR及Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定后，经Pac Ⅰ 线性化后用于转染HEK-293细胞，获得重组腺病毒，通过绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）的表达来监控重组腺病毒的复制情况，用Western-blot法分别检测糖蛋白和VP2蛋白的表达，并测定重组病毒的滴度。结果显示，克隆出IHNV G基因和IPNV VP2基因，基因长度为3036 bp，构建出目的基因重组腺病毒载体。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物，其滴度为1.0×10~(9.5)mL~(-1)。结果表明，成功获得IHNV G基因和IPNV VP2基因重组腺病毒，该病毒在HEK-293细胞中滴度较高，能够稳定表达。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 赵海平 杨福合 邢秀梅 刘国庆 李春义
研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵敬贤 李娟 严兴荣 倪和民 陈燕 张路培 高会江 许尚忠 李俊雅 高雪
[目的]对前期获得的3头转基因牛进行分子生物学评价,包括转基因阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,旨在进一步为转基因牛的安全评价提供一些科学依据。[方法]根据Gen Bank上公布的牛FABP4基因(Gen Bank登录号:NM_174314)m RNA序列,利用兼并密码子对现有FABP4基因进行突变,并构建了p EGFP-C1-FABP4真核表达载体、通过细胞转染、体细胞核移植、胚胎移植技术获得3头转基因牛;分别采集了1号转基因牛不同组织样,2、3号转基因牛与野生型个体8、10、12、14月龄的血液样本,利用RT-PCR技术对所获转基因个体的阳性与否进行了鉴定;同时利用荧光定量PCR技术检测...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
贾立军 张守发
【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
季舒涵 昝林森 王洪宝 刘艳妍
【目的】克隆秦川牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因,并对其进行生物信息学分析,为深入研究A-FABP基因与秦川牛肉质性状的关系奠定基础。【方法】以秦川牛脂肪组织为材料,采用RT-PCR方法对牛A-FABP基因进行克隆。使用DNAMAN、NCBI等一系列在线软件及工具,对所得到的序列及其编码蛋白质的结构和特性等进行生物信息学分析。【结果】秦川牛A-FABP基因含有15个酶切位点,编码的蛋白分子质量为14.7 ku,二级结构主要以α-螺旋、不规则盘绕和延伸链为结构元件,含132个氨基酸,其中强碱性氨基酸18个,强酸性氨基酸19个,疏水氨基酸45个,不带电荷的极性氨基酸32个;含有6个蛋白激...
关键词：
A-FABP基因 生物信息学 秦川牛
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