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[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐建强 周裕军 张聪 周明国
【目的】在大肠杆菌中表达禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的β2-微管蛋白,筛选使β2-微管蛋白可溶性表达的诱导因子,并对可溶性蛋白进行纯化。【方法】以构建好的质粒(pET32a+-β2-tubulin)为模板,PCR扩增出β2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,并转化到表达宿主菌BL21(DE3)及Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子;对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证。【结果】获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆;为了克服常规诱导条件下表达的β2-微管蛋白主要...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。
关键词：
β2微球蛋白 重组蛋白 包涵体 复性
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王艳芳 周雅坪 张新竹 李松建 麻昌姣 黄海碧 郝永清
为研究分子伴侣是否可以促进牛支原体膜蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达及表达的蛋白是否具有活性,应用原核表达和Western blot方法进行检测,结果表明:1)牛支原体一个膜蛋白M1的截短片段在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达,改变诱导时间、温度以及诱导剂浓度均未改变其表达形式;2)将4种分子伴侣pGKJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16分别与含有目的蛋白的重组质粒在表达工程菌(BL21)中共表达,当加入终浓度为1.0mmol/L IPTG以及0.5mg/mL L-阿拉伯糖或5.0ng/mL四环素的诱导剂,37℃诱导5h,发现分子伴侣pGTf2和pG-KJE8能显著提高M1截短片段的可溶性表达,其他2种分子伴侣未改变M1的表达形式;3)可溶性表达的M1截短片段与牛支原体阳性血清可以发生特异性反应。因此,研究发现2种分子伴侣可以使牛支原体膜蛋白在大肠杆菌表达系统中以可溶性形式表达,但未改变其生物活性,该研究结果可为建立牛支原体有效的血清学诊断方法及亚单位疫苗的研制奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 张正斌 王晓军 徐萍
NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张聪 徐建强 于俊杰 陈长军 王建新 周明国
分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisT...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
牛传双 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄炜 余瑛 鲁秀敏 方佳佳 蒋丽
为了建立小鼠FGF9的原核表达体系,获得纯化的FGF9重组蛋白,采用PCR技术扩增FGF9,并将其克隆入原核表达载体pET30a(+)中,经测序验证后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,采用亲和层析技术进行目的蛋白的纯化,并用Western blotting进行了免疫原性验证。测序结果显示插入到载体中的片段与FGF9的天然序列一致,在BL21(DE3)中表达出了可溶性的FGF9重组蛋白,其表达量达到总蛋白的40%;用镍螯合亲和层析方法获得了纯度大于95%的FGF9重组蛋白。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
曹晓风 赵武玲 吴玮 阎隆飞
高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中
关键词：
肌动蛋白 基因表达 包涵体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱春平 李燕 吴亚丽 常婧竹 刘琳 高文明 李新生
【目的】克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV)A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因,为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA,用RT-PCR扩增NP基因,将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体,构建重组表达载体,并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,同时考察IPTG不同浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和不同诱导时间(2,4,6,8h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】克...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张锋 赵晓瑜 周艳芬
合成透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的天然低氧启动子,与vgb结构基因拼接得到570 bp的vgb基因,将该基因克隆到pUC18质粒中重组为pUC_LV质粒,转化大肠杆菌得到重组子。通过低氧诱导10 h后,重组菌的密度较对照增加了67.4%,经SDS_PAGE和CO差光谱分析证明重组菌表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb)。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古英洪 汤浩茹 张义正
【目的】克隆桃(Prunus persica)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
罗维 余兴龙 白霞 李润成 侯强红 尹恒
根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.
关键词：
大肠杆菌 fedF基因 克隆 表达
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