【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(c GAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70～90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43 708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中c GAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P <0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P <0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。

为进一步研究的生物学特性,应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肾细胞(CEK)培养禽腺病毒江苏分离株,进行培养特性、血凝特性、理化特性、超薄切片观察和PCR检测。实验结果表明,CEF感染病毒后没有出现病变。CEK感染病毒后则表现出很强的聚集性并形成细胞团,有的成束状,最后脱落;ReedMuench方法测得其TCID50为每0.1mL10-5.4。CEK核内存在大量70～80nm、呈典型的晶格状排列的腺病毒颗粒。

为建立禽腺病毒4型的禽源细胞感染模型,并考察细胞培养毒株对动物的致病性,将实验室2014-2017年间分离的5株血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH)并盲传,选取各病毒的LMH细胞培养物,按一定剂量经腿部肌肉注射接种4周龄SPF鸡;记录试验动物的发病情况,剖检采集发病或死亡鸡的脏器并制作病理切片,观察并分析病毒细胞培养物感染SPF鸡的组织病理变化。结果发现:5株血清4型禽腺病毒在LMH细胞上盲传至第4代时开始出现I群禽腺病毒所致的特异性细胞病变,提取培养物中病毒核酸并进行PCR鉴定,均能扩增出大小约564bp的特异性扩增片段,表明病毒能在LMH细胞上稳定增殖。选取各病毒第10代细胞培养物进行SPF鸡回归试验,发现细胞培养上清接种4周龄SPF鸡后第3天开始,有部分鸡开始精神沉郁,食欲消退、卧地不起瘫痪并迅速死亡,病理剖检及病理组织切片结果显示HB-1、HB-2、HB-3和SD-1毒株保持对4周龄SPF鸡的致病性,病死鸡中能观察到典型的组织病理学变化,而对照组不出现任何临床症状及病理变化。以上结果表明,LMH细胞可用于禽腺病毒增殖传代,是开展禽腺病毒分子致病机制研究的理想细胞模型。

干扰素 (IFN)在诱导细胞的抗病毒和抗生长反应及调节免疫反应中起关键作用 .尤其是抗病毒反应是干扰素的基本功能 ,其分子机制正逐步被揭示 .IFN诱导的过程实际上是一个信号传递和级联放大的过程 .其主信号途径通过位于细胞膜上的酪氨酸激酶使酪氨酸磷酸化 ,激活信号传导物和转录激活因子 .然后信号传导物和转录激活因子转移到细胞核内 .它们导致了许多基因产物的表达并由此产生一系列的生理学过程

【目的】本文研究Ⅹ蛋白（Protein Ⅹ，pⅩ）在血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus Serotype 4，FAdV-4）感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响，为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α- HA-X。将重组表达质粒pEF1α-HA-X和空质粒pEF1α-HA分别转染LMH细胞，24 h后用FAdV-4感染转染后的细胞，2个处理组分别标记为pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+；同时设立转染后未加病毒刺激组作对照，分别标记为pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。用Western-blotting和间接免疫荧光验证重组蛋白表达情况，实时荧光定量PCR检测Toll样受体（chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21）和效应因子（IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15）mRNA转录水平的变化。【结果】X基因开放阅读框（ORF）全长540 bp，共编码179个氨基酸残基。Western-blotting结果显示重组X蛋白与HA标签小鼠源单克隆抗体反应，在27 kD处得到单一条带，间接免疫荧光结果可见绿色荧光。实时荧光定量PCR检测发现，与pEF1α-HA-组相比较，pEF1α-HA-X-组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著上调（P<0.01，下同），分别为pEF1α-HA-组的9.76和12.34倍；chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA转录水平显著上调（P<0.05，下同)。添加病毒感染后，与pEF1α-HA-X-组相比，pEF1α-HA-X+组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著下调，分别下调60%和66.7%；chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA转录水平显著提高，分别上调2.91、2.01和1.47倍（P<0.05），其他chTLRs的mRNA转录水平下调，但差异不显著（P>0.05）；同时，pEF1α-HA-X+组效应因子IFN-α、IFN-β、IL-1β的mRNA转录水平比pEF1α-HA-X-组显著上调，IL-8的mRNA转录水平极显著下调。【结论】在LMH细胞过表达pX并被FAdV-4感染后，pX能激活宿主免疫应答系统，Toll样受体（chTLR2a、chTLR2b和chTLR3）和其效应因子（IFN-α、IFN-β和IL-1β）的mRNA转录水平显著上调以抑制病毒复制，说明pX具备激活宿主细胞天然免疫系统的功能。

【目的】分析血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Ⅷ蛋白（Protein Ⅷ，pⅧ）对宿主天然免疫相关基因表达的影响，为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒（试验组）和pEF1α-HA空质粒（对照组）转染LMH细胞，利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况，实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-ΚB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框（ORF）全长744 bp，共编码247个氨基酸残基，真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应，在34 kD处得到单一条带；间接免疫荧光检测可见绿色荧光，说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比，Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后，模式受体STING基因的表达水平显著提高了5.6倍（P<0.05，下同），MDA5基因的表达水平提高了30%；接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高了1.5和2.4倍；转录因子IRF7的表达水平显著提高了3.4倍，而NF-ΚB基因被抑制表达。同时，干扰素（IFN-α和IFN-β）和白介素（IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的表达水平均上调，IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍（P

选择５种不同细菌来源的鞭毛素蛋白刺激猪外周血淋巴细胞，利用荧光定量ＰＣＲ检测相关细胞因子白介素４（ＩＬ－４）和γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）ｍＲＮＡ的表达水平，进一步选择４个含量（０．１、１．０、５．０、１０．０μｇ·ｍ Ｌ～（－１））的创伤弧菌鞭毛素蛋白，探讨其诱导ＩＦＮ－γ的表达效果．结果表明，鞭毛素蛋白可以显著提高ＩＦＮ－γｍＲＮＡ的表达水平（Ｐ

【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品进行了Hexon全基因的扩增、克隆、测序和遗传进化分析。【结果】通过扩增Hexon基因421bp的片段,成功建立了禽腺病毒4型的PCR检测方法;40份家禽肝脏样品中,PCR检测显示35份为FAV-4阳性,阳性率为87.5%;成功扩增了包含Hexon基因全序列的

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PG...

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。

目前,奶牛的亚急性瘤胃酸中毒(SARA)的发生率较高,这是因为瘤胃中革兰氏阴性菌(GNB)崩解释放大量脂多糖(LPS)引起的。脂多糖刺激后,会导致一系列的细胞因子级联反应,相应的乳蛋白及其他物质也会发生变化,对奶牛生产产生了很不利的影响。笔者就脂多糖刺激对奶牛细胞因子、乳蛋白及其他物质的变化做一具体综述。

【目的】研究烟草细胞对parasiticein的反应,了解parasiticein诱导烟草细胞的PCD的发生机制。【方法】用浓度约100nmol·L-1的parasiticein处理烟草悬浮细胞,相差显微镜下观察细胞的形态变化。【结果】发现烟草细胞的细胞膜收缩,与细胞壁间形成空隙,原生质浓缩等;用trypanblue染色后观察到类似现象。对诱导处理的悬浮细胞经DAPI(4,6-diamino-2-phenylindole)染色后,通过荧光显微镜观察,发现细胞核先后表现染色质凝集、形成颗粒状等特征;对处理的悬浮细胞提取基因组DNA并进行琼脂糖凝胶电泳,可观察到梯状的DNA条带(DNA ladde...

为了研究类猪圆环病毒2型因子P1和P2体外诱导的细胞凋亡作用,将P1和P2分子克隆分别转染PK-15细胞。结果表明,用透射电镜可以观察到P1和P2诱导PK-15细胞出现凋亡的典型形态学变化。

研究类猪圆环病毒2型因子P1体内诱导的细胞凋亡作用。将P1分子克隆接种普通仔猪,用原位末端标记技术(TUNEL)检测猪的扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结等免疫器官细胞的凋亡情况。猪感染P1后21和35 d的扁桃体、脾脏和腹股沟淋巴结等免疫器官细胞出现了凋亡。P1可能引起猪的免疫抑制。

2009年12月从疑似新城疫的商品肉鸡中分离到一株具有血凝性的病毒,经血清学和RT-PCR鉴定,确认为鸡新城疫病毒。该纯化病毒的MDT(最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间)为56 h,ICPI(1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数)为1.76,ELD50(鸡胚半数致死量)为10-8.5;序列分析表明,该分离株F蛋白基因长1662 bp,编码553个氨基酸,推导的F基因氨基酸序列裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,具备强毒的典型特征。经对F基因的全序列分析,该病毒与鸡新城疫病毒F48E9株,La Sota株的核苷酸同源性分别为85.9%、83.4%,与TCQQ/Tianjin/08...