为进一步研究的生物学特性,应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肾细胞(CEK)培养禽腺病毒江苏分离株,进行培养特性、血凝特性、理化特性、超薄切片观察和PCR检测。实验结果表明,CEF感染病毒后没有出现病变。CEK感染病毒后则表现出很强的聚集性并形成细胞团,有的成束状,最后脱落;ReedMuench方法测得其TCID50为每0.1mL10-5.4。CEK核内存在大量70～80nm、呈典型的晶格状排列的腺病毒颗粒。

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法，明确其分类地位，用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料（FD201807和SA201808）肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系（mandarin fish fry cell line-1，MFF-1）并连续传代，从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA，克隆病毒主要衣壳蛋白基因（mcp），测序后与NCBI Genebank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示，病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变，细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强；感染时间越长脱壁细胞越多，同时培养液中的颗粒增加；透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130～150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短，第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d，第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7～8 d。mcp序列比对和聚类分析发现SA201808株和FD201807株为虹彩病毒科、肿大细胞病毒属的不同病毒，SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异，二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus， LYCIV)LYCIV-Zhoushan（GenBank: MW139932.1）和花鲈虹彩病毒（Lateolabrax maculatus iridovirus， LMIV）（GenBank: MH577517.1）相近。15株从大黄鱼病料检出的病毒中，12株的mcp序列与SA201808株聚类；3株与FD201807聚类。本研究首次利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒，揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异，为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。

为建立禽腺病毒4型的禽源细胞感染模型,并考察细胞培养毒株对动物的致病性,将实验室2014-2017年间分离的5株血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH)并盲传,选取各病毒的LMH细胞培养物,按一定剂量经腿部肌肉注射接种4周龄SPF鸡;记录试验动物的发病情况,剖检采集发病或死亡鸡的脏器并制作病理切片,观察并分析病毒细胞培养物感染SPF鸡的组织病理变化。结果发现:5株血清4型禽腺病毒在LMH细胞上盲传至第4代时开始出现I群禽腺病毒所致的特异性细胞病变,提取培养物中病毒核酸并进行PCR鉴定,均能扩增出大小约564bp的特异性扩增片段,表明病毒能在LMH细胞上稳定增殖。选取各病毒第10代细胞培养物进行SPF鸡回归试验,发现细胞培养上清接种4周龄SPF鸡后第3天开始,有部分鸡开始精神沉郁,食欲消退、卧地不起瘫痪并迅速死亡,病理剖检及病理组织切片结果显示HB-1、HB-2、HB-3和SD-1毒株保持对4周龄SPF鸡的致病性,病死鸡中能观察到典型的组织病理学变化,而对照组不出现任何临床症状及病理变化。以上结果表明,LMH细胞可用于禽腺病毒增殖传代,是开展禽腺病毒分子致病机制研究的理想细胞模型。

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(c GAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70～90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43 708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中c GAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P <0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P <0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。

【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细...

进行了 禽脑脊 髓炎病 毒 Ｌ２ Ｚ 株在 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 传 代 细胞 系上 培 养特 性的 研 究。该 毒 株 在细胞上盲 传３ 代后 能产生明 显的细 胞病变，并 且传代 过程中 细胞 病变 稳定 地出 现。利 用琼 脂扩 散试验、免疫 荧光试 验、免疫酶 试验及 负染电镜 观察 研究 表 明， Ｌ２ Ｚ 株 接种 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 细 胞具 有良 好 的增殖特性 ，并且病 毒是在细 胞浆中 进行复制 。该研究 报道禽 脑脊髓 炎病 毒能 成功 地在 传代 细胞 系上培养增 殖。

【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insu...

实验选用４种鱼类传代细胞，对首次发现的鳗鲡“狂游病”的病原鳗鲡冠状病毒样病毒进行了细胞分离与培养。本研究在鲤上皮乳头状瘤细胞（ＥＰＣ）中复制了鳗鲡冠状病毒样病毒粒子，并经病毒细胞培养物的电镜负染和超薄切片法检查得到了证实。

在用非免疫鸡胚增殖鸭病毒性肝炎病毒 (E5 2株 )过程中 ,发现种毒受到污染。采用聚乙二醇沉淀 SephadexG10 0柱层析法纯化污染病毒 ,在电镜下发现一大小为 70～ 80nm ,无囊膜 ,2 0面体对称的病毒颗粒。挑选 4条随机引物对其进行反转录PCR扩增 ,共扩增出 3条基因片段。序列分析结果表明 ,与禽腺病毒 (鸡胚致死孤儿病毒 )基因组部分序列同源性分别高达 99 5 %、 99 6 %和 99 5 % ,从而证明禽腺病毒污染了鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒

【目的】研究福建南平地区禽腺病毒(FAdV)血清8a型分离株的遗传演化情况及致病性，旨在为防控血清8a型FAdV感染提供参考。【方法】2022年8月，采集福建南平地区部分肉鸡养殖场出现的以包涵体肝炎为特征的肝脏病料，采用PCR技术检测FAdV核酸，将获得的阳性样品接种在无特定病原体(SPF)鸡胚上进行病原的分离纯化，利用hexon基因测序及序列分析等方法进行病毒鉴定，并在测定分离株毒力的基础上进行动物致病性试验。【结果】接种10 d后，鸡胚死亡，肝脏肿大、出血、坏死、呈土黄色；PCR鉴定和hexon基因序列分析表明，分离株与GenBank上的FAdV E型8a血清型澳大利亚TR59毒株的序列同源性高达99.5%,将该分离株命名为FJNP。FJNP株对1日龄SPF鸡的致死率为44%(11/25);剖检显示，感染鸡肝脏肿大、出血、边缘钝圆、呈土黄色、出现白色坏死点，脾脏和肾脏也出现肿大、出血等症状；肝脏组织病理学检查结果显示，感染鸡肝细胞大量变性坏死，肝细胞核可见嗜碱性包涵体及大量淋巴细胞浸润。实时荧光定量PCR检测显示，感染鸡体内多个组织器官均检测到病毒，且主要分布在肝脏，攻毒3、5、7、14、21 d在泄殖腔中均能检测到病毒。【结论】本研究从临床表现为包涵体肝炎的病鸡肝脏病料中分离到一株具有较强致病性的血清8a型FAdV。

【目的】本文研究Ⅹ蛋白（Protein Ⅹ，pⅩ）在血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus Serotype 4，FAdV-4）感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响，为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α- HA-X。将重组表达质粒pEF1α-HA-X和空质粒pEF1α-HA分别转染LMH细胞，24 h后用FAdV-4感染转染后的细胞，2个处理组分别标记为pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+；同时设立转染后未加病毒刺激组作对照，分别标记为pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。用Western-blotting和间接免疫荧光验证重组蛋白表达情况，实时荧光定量PCR检测Toll样受体（chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21）和效应因子（IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15）mRNA转录水平的变化。【结果】X基因开放阅读框（ORF）全长540 bp，共编码179个氨基酸残基。Western-blotting结果显示重组X蛋白与HA标签小鼠源单克隆抗体反应，在27 kD处得到单一条带，间接免疫荧光结果可见绿色荧光。实时荧光定量PCR检测发现，与pEF1α-HA-组相比较，pEF1α-HA-X-组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著上调（P<0.01，下同），分别为pEF1α-HA-组的9.76和12.34倍；chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA转录水平显著上调（P<0.05，下同)。添加病毒感染后，与pEF1α-HA-X-组相比，pEF1α-HA-X+组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著下调，分别下调60%和66.7%；chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA转录水平显著提高，分别上调2.91、2.01和1.47倍（P<0.05），其他chTLRs的mRNA转录水平下调，但差异不显著（P>0.05）；同时，pEF1α-HA-X+组效应因子IFN-α、IFN-β、IL-1β的mRNA转录水平比pEF1α-HA-X-组显著上调，IL-8的mRNA转录水平极显著下调。【结论】在LMH细胞过表达pX并被FAdV-4感染后，pX能激活宿主免疫应答系统，Toll样受体（chTLR2a、chTLR2b和chTLR3）和其效应因子（IFN-α、IFN-β和IL-1β）的mRNA转录水平显著上调以抑制病毒复制，说明pX具备激活宿主细胞天然免疫系统的功能。

【目的】分析血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Ⅷ蛋白（Protein Ⅷ，pⅧ）对宿主天然免疫相关基因表达的影响，为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒（试验组）和pEF1α-HA空质粒（对照组）转染LMH细胞，利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况，实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-ΚB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框（ORF）全长744 bp，共编码247个氨基酸残基，真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应，在34 kD处得到单一条带；间接免疫荧光检测可见绿色荧光，说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比，Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后，模式受体STING基因的表达水平显著提高了5.6倍（P<0.05，下同），MDA5基因的表达水平提高了30%；接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高了1.5和2.4倍；转录因子IRF7的表达水平显著提高了3.4倍，而NF-ΚB基因被抑制表达。同时，干扰素（IFN-α和IFN-β）和白介素（IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的表达水平均上调，IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍（P

研究了元宝草悬浮细胞生长及其金丝桃素类物质(金丝桃素和假金丝桃素)的代谢规律。悬浮培养细胞的生长周期为18 d,其中4~10 d是对数期。金丝桃素类物质在10 d达到46.06μg/g(DW),其含量增加与细胞鲜质量增长相偶联。可溶性糖的消耗与细胞的生长以及金丝桃素类物质的代谢有着密切的关系,是影响细胞鲜质量和金丝桃素类物质增长的重要因素。

旋转培养优于静置培养,它不仅表现在可形成细胞单层的面积大,单层细胞的产量高,单位面积所需的培养液(维持液)少,而且细胞生长的速度较快,细胞形成单层的时间较短,接种病毒后收获的病毒滴度也相应较高,它适宜于疫苗工厂化生产。