【目的】明确福建省茶树主要病毒种类和分布情况，并建立同时快速检测多种病毒的多重PCR检测技术。【方法】2019—2023年，从福建省福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地市区采集具有褪绿、皱缩和坏死等疑似病毒感染症状的茶树样品1 869份，采用高通量测序技术结合PCR和RT-PCR检测的方法对茶树病毒病的病原进行鉴定，并将PCR扩增获得的特异性目的片段进行克隆和测序，对获得的序列进行系统发育分析；同时，根据GenBank上已报道的病毒序列设计特异性引物，通过退火温度、引物浓度、循环数等反应条件和反应程序的优化，建立同时检测福建茶树主要病毒的多重PCR检测技术，并测定该技术的特异性、灵敏度及实际应用效果。【结果】从所采集的茶树病样上检出3种病毒，按检出率从高到低依次为油茶双生病毒（oil tea associated geminivirus,OTaGV）(48.90%)、茶树坏死环斑病毒（tea plant necrotic ring blotch virus,TPNRBV）(26.75%)和茶树潜隐病毒1(camellia cryptic virus 1,CCV1)(17.98%)；在检出病毒的1 258份样品中，有807份为OTaGV、TPNRBV或CCV1单独侵染，检出率分别为37.20%、21.38%和5.56%；其余451份样品为2种或3种病毒复合侵染，复合侵染检出率达35.85%,OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4种类型复合侵染检出率分别为17.49%、0.40%、14.71%、3.26%。在地理分布上，OTaGV在福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地区均有分布，其中漳州OTaGV检出率最高，为96.77%;CCV1在福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田和龙岩8个地区均有分布，其中三明CCV1检出率最高，为66.00%;TPNRBV在福州、南平、宁德、泉州和漳州5个地区均有分布，其中泉州TPNRBV检出率最高，为79.13%；在福建省9个地区中，厦门地区仅检出OTaGV，三明、莆田和龙岩地区检出OTaGV和CCV1，其他5个地区同时检出OTaGV、TPNRBV和CCV1；福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田7个地区检测到病毒复合侵染，其中漳州地区病毒复合侵染检出率最高（85.00%）、宁德地区病毒复合侵染检出率最低（23.03%）。利用测定的CCV1和TPNRBV部分基因序列构建系统发育树，结果表明本研究获得的CCV1分离物（FW）与已报道的福建分离物FJ-SH104(GenBank登录号：ON807095)亲缘关系最近、TPNRBV分离物（FU）与福建分离物QZHA92(GenBank登录号：OQ948454)亲缘关系最近。经优化建立的多重PCR检测技术特异性强，仅OTaGV、TPNRBV和CCV1能扩增出特异性目的片段，而其他病毒及健康茶树样品上均未扩增出特异性目的片段；多重PCR灵敏度最低可以检测到稀释至10-4倍的OTaGV、TPNRBV和10-3倍的CCV1；利用该多重PCR检测技术对茶园中采集的60份病样进行检测，检测结果与单一PCR检测结果完全相符。【结论】OTaGV、TPNRBV和CCV1是当前福建茶树上主要病毒种类，其中OTaGV为福建地区首次报道，该病毒可侵染茶树也为首次发现；在检出的3种病毒中，以OTaGV发生分布范围最广，其次为CCV1、TPNRBV；福建地区茶树病毒目前仍以单独侵染为主，但同时存在较多的复合侵染，复合侵染类型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+CCV1+TPNRBV；建立的多重PCR检测技术特异性强、灵敏度高，可用于茶园茶树上OTaGV、CCV1和TPNRBV3种病毒的快速检测。研究结果可为福建茶树病毒病的综合防控提供理论依据和技术支持。

[目的]建立乐都紫皮大蒜4种病毒的多重RT-PCR快速检测方法,为大蒜病毒病病原鉴定、脱毒效果验证等提供技术支撑。[方法]根据乐都紫皮大蒜RNA全长转录组测序结果,分别设计洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)、大蒜D病毒(garlic virus D,GarVD)和大蒜X病毒(garlic virus X,GarVX)4种病毒的外壳蛋白特异性引物,筛选不同引物,优化引物用量、模板用量、退火温度等条件,并进行了多重RT-PCR的灵敏度检测和12份引进栽培大蒜种质资源的病毒检测。[结果]通过优化筛选,在一个PCR反应体系中实现了OYDV(1 232 bp)、GLV(831 bp)、GarVD(506 bp)和GarVX(116 bp)4种病毒的多重检测,最优反应条件为退火温度55℃,模板用量2.5μL,混合引物用量各1.0μL。多重RT-PCR的灵敏度略低于单一RTPCR。对引进的12份栽培大蒜资源进行4种病毒的多重RT-PCR检测发现,有5份资源存在4种病毒,4份资源存在2种病毒,3份资源存在1种病毒。对7份资源中经多重PCR未检测到的病毒,使用单一RT-PCR进行检测和验证发现,除1份内蒙古资源(NMG)的1种病毒(GarVX)外,多重RT-PCR结果与单一RT-PCR检测结果一致。[结论]本研究建立的大蒜多重RT-PCR体系可靠性强,可用于大蒜病毒的检测与防控。

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对...

【目的】建立鉴别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和安卡拉病毒(FAV-4)的多重PCR检测方法。【方法】根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列,设计合成了3对特异性引物。提取3种病毒DNA/RNA,通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。应用建立的多重PCR方法对67份临床病料进行检测,并将其结果与已建立的单重PCR检测结果进行比较。【结果】成功建立了能快速鉴

根据舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因(egt)设计一对特异性引物,成功建立了LdMNPV的PCR检测技术体系,其对LdMNPV基因组的灵敏度可达到1 fg.mL-1。应用该技术体系从舞毒蛾带毒幼虫、卵、蛹的基因组中扩增出目的片段,证明了这一技术的可行性。对不同浓度的多角体悬液的扩增结果显示:其检测最低量为5 OBs·mL-1。形态学研究表明:从内蒙舞毒蛾体内分离到的LdMNPV中,少数表面有凹陷的孔洞,病毒粒子从这些孔洞中游离出来,这也阐明了此技术能够从多角体悬液中扩增出目的片段的原因。在将来LdMNPV的检测中,可用虫体进行研磨过滤离心得到的组织液作...

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类,明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年,在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市(区)采集253份疑似感病的辣椒植株叶片,提取叶片总RNA和总DNA,利用双生病毒的通用引物(PA/PB)、马铃薯卷叶病毒属通用引物(POL-F/POL-R)及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定,将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上,再送至公司进行克隆

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒—甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列，利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物；以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板，在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增，初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系；通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化，建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系，并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示，优化的多重RT-PCR体系，各病毒引物之间不会出现交叉干扰，所扩增的4条目的条带清晰，能够明确区分上述4种甘薯病毒；挑战检测和灵敏度测试显示，此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒，不仅准确灵敏，而且降低了检测成本，提高了病毒检测效率。

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...

淋巴囊肿病毒（ＬＣＤＶ）、肿大细胞病毒属虹彩病毒（Ｍｅｇａ）、赤点石斑鱼神经坏死病毒（ＲｇＮＮＶ）、传染性造血器官坏死病毒（ＩＨＮＶ）、传染性胰脏坏死病毒（ＩＰＮＶ）、病毒性出血败血症病毒（ＶＨＳＶ）和传染性鲑鱼贫血症病毒（ＩＳａＶ）是养殖鱼类主要的病毒性病原，危害巨大。为实现这７种病原的高通量、同步检测，本研究在分析这７种病毒基因序列的基础上，设计了９组扩增子拯救多重ＰＣＲ（ａＲＭ－ＰＣＲ）引物，并对扩增体系中的Ｔａｑ酶、Ｍ～ｇ（２＋）、Ｄ ＮＴＰ、ＰＲＩＭｅＲ ＭＩｘ浓度及退火温度等参数进行调整和优化，结合基因芯片检测技术，建立了同步检测７种鱼类病毒的ａＲＭ－ＰＣＲ方法。优化后的ａＲＭ－Ｐ．．．

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶序列和西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜绿斑花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因序列以及南瓜花叶病毒(SQMV)的运动蛋白序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增。对2002-2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果表明,天津地区黄瓜主要毒原种类有CMV,WMV-2和TMV,感染率分别为样本数的96.94％,77.55％和38.67％,CMV和WMV-2 2种病毒的复合感染率为76.53％,3种病毒的复合感染率达到14.67％。

根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV特异性扩增片段435 bp,IHHNV特异性扩增片段301 bp和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0...

在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病...