[目的]本实验旨在探究神经介素B（neuromedin B， NMB）及其受体[神经介素B受体（neuromedin B receptor， NMBR）、胃泌素释放肽受体（gastrin releasing peptide receptor， GRPR）和蛙皮素受体（bombesin receptor subtype 3， BRS3）]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节的机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只（3和9月龄，各6只）进行阉割并采集睾丸组织，在NMB及其受体基因克隆与序列分析的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于七次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低（P<0.05），而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增高（P<0.05）。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节，丰富了家畜生殖生理学的研究。

[目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄，各6只)进行阉割并采集睾丸组织，在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节。

为进一步揭示蒙古马发育与生殖调控的分子机制提供试验数据和理论依据,研究不同发育年龄蒙古马睾丸组织中生长激素(Growth hormone,GH)、生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)、胰岛素样生长因子Ⅰ(Insulin-like growth factorsⅠ,IGF-Ⅰ)和胰岛素样生长因子Ⅰ受体(Insulin-like growth factorⅠreceptor,IGF-ⅠR)表达的发育性变化模式,以性成熟前期(5匹)、性成熟期(5匹)、成年期(5匹)的蒙古公马为研究对象,采集其睾丸组织,利用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)对不同发育年龄蒙古马睾丸组织中的GH、GHR、IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因的表达差异进行分析,采用免疫组织化学方法对性成熟前期和性成熟期蒙古马睾丸组织中的GH和IGF-Ⅰ蛋白质进行定位。RT-qPCR试验结果表明蒙古马睾丸组织中上述4个基因的表达量从性成熟前期到性成熟期显著增加,成年期下降。免疫组织化学结果表明GH和IGF-Ⅰ免疫标记定位于精母细胞、精原细胞、精子细胞和睾丸间质细胞,其在相关细胞中的信号从性成熟前期到性成熟期逐渐增强。研究发现睾丸组织中GH、GHR、IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR的mRNA协同表达对蒙古马睾丸发育和性成熟有重要调节作用,GH和IGF-Ⅰ蛋白可能通过自分泌/旁分泌的方式调节蒙古马的精子形成和睾丸间质细胞的功能。

前黑素小体蛋白a (premelanosome protein， pmela)基因是黑色素合成通路中的关键基因之一，对动物的体色有着重要影响。为探讨pmela基因在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends， RACE)技术对pmela基因cDNA全长进行克隆并运用生物信息学方法分析该基因的序列特征，同时采用qRT-PCR比较pmela在野生型虹鳟(虹鳟)、黄色突变型虹鳟(金鳟)和杂交F_(1)代受精期至孵化后3个月不同发育时期及成鱼不同组织中的相对表达量。研究获得pmela基因cDNA全长序列3476 bp，包含2532 bp开放阅读框，编码843个氨基酸。序列分析发现，Pmela为疏水性蛋白且存在PKD功能结构域。同源性比对发现，虹鳟Pemla氨基酸序列与红鲑(Oncorhynchus nerka)的同源性高达97.75%；进化分析结果显示，虹鳟与红鲑的亲缘关系最近，与人类(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远。qRT-PCR结果显示，pmela基因在虹鳟与金鳟胚胎及出膜后各时期均有表达，在受精期至16细胞期中的表达为虹鳟高于金鳟，出膜后该基因在金鳟背部皮肤中的表达均高于虹鳟，且在4细胞期、16细胞期、原肠期、神经期、体节期、心跳期、1 day post-hatching (1 dph)、3 dph、5 dph、7 dph、10 dph、1 month post-hatching (1 M)和2 M时期中，虹鳟与金鳟的表达存在显著差异。在各组织中，pmela基因在虹鳟与金鳟背部皮肤和眼睛中的表达显著高于其他组织。在杂交F_(1)代中，pmela基因在不同发育时期和组织中的表达模式与双亲类似，且在大部分相同时期和组织中的表达与双亲存在显著差异。上述结果表明，pmela基因的表达量高低与虹鳟体色具有一定的相关性，且可能参与其体色的形成过程。本研究结果为进一步研究pmela基因在虹鳟体色变异中的作用提供基础资料。

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20—22个核苷酸(nt)且高度保守的非编码小RNA。迄今为止,在病毒、动物、植物中都有发现,如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制,在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能,试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列;分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平,及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义;为进一步研究mi...

为深入研究成纤维细胞生长因子5对毛囊生长发育的生物学功能提供理论依据。在10月左右和1月左右,即皮肤毛囊处于生长旺期和退行期时采集了12只内蒙古阿尔巴斯白绒山羊皮样,利用TRIZOL试剂盒提取皮肤总RNA(一步法),利用RT-PCR方法检测FGF5基因在绒山羊绒毛周期性生长不同阶段皮肤中的表达分布情况,试验结果表明,FGF5基因mRNA在绒山羊毛囊生长旺期和退行期均有表达,却只得到了一种剪切形式的表达,经测序是长片段,而缺失外显子2的短片段形式没有检测到。

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状...

【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因－苯丙胺调节转录肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ｃａｒｔ）的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ｏｄＦ１（ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）和ｏｄＦ２（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）颗粒细胞（ｇｒａｎｕｌｅｓａ ｃｅｌｌｓ，ｇｃｓ）构建ｒｎａ文库，ｉｌｌｕｍｉｎａ ｈｉ ｓｅｑ ２０００平台测序；采集屠宰牛双侧卵巢，通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二．．．

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,>1.5~≤3.0mm,>3.0~≤5.0mm,>5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最...

为了解析鸡胚发育过程中NANOG、POUV和TWIST2基因的调控作用,利用荧光定量RT-PCR方法,研究NANOG、POUV和TWIST2基因在孵化1~6d(E1~E6)的整体胚胎和孵化15和18d(E15、E18)鸡胚的大脑、心脏、肝脏和左侧大腿肌肉组织中的表达谱。结果表明,1)NANOG基因的表达水平在E2~E6整胚和E15、E18胚期的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均极显著低于E1时期(P<0.01)。2)在鸡胚发育的整胚E1~E6和E15、E18时期的大脑、肝脏、心脏和腿肌中,POUV基因的表达水平基本呈现逐渐降低趋势,且从E3时期后均显著低于E1时期(P<0.05或P<0.01...

【目的】分析β-连环蛋白(β-catenin)在不同发育阶段日本血吸虫体内的表达特征,为研究Wnt/β-catenin信号通路对虫体发育的调控奠定基础。【方法】以7 d童虫cDNA为模板,通过RACE技术获得日本血吸虫β-catenin基因全长cDNA序列。采用实时定量PCR分析该基因mRNA在不同发育阶段日本血吸虫体内表达水平的变化。以含有多个抗原表位的β-catenin部分cDNA序列为模板,构建原核pET28a-β-catenin-310重组质粒,表达β-catenin蛋白。以纯化的原核表达产物为抗原,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,以此抗血清为一抗,通过Westernblotting分...

随机选取0、3、20、30、90、120和180日龄二花脸公猪和大白公猪各4头,用相对定量RT-PCR法研究睾丸组织中生长激素受体(GHR)基因表达的发育性变化。结果表明,二花脸猪与大白猪睾丸GHR mRNA表达的发育模式不同,二花脸猪GHR mRNA相对表达量从0到30日龄逐渐上升,在90和120日龄呈阶段性降低(P

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。

【目的】研究18S核糖体RNA(18SrRNA)、延伸因子1-α(EF1-α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)等5种常见内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染下的稳定性,为大鲵后基因组学研究提供指导。【方法】采集3龄健康大鲵的肝脏、肠、胃、胰腺、肾脏、肌肉、皮肤、脾脏等组织,3龄、2龄、1龄、9月龄、1周龄健康大鲵的皮肤组织及嗜水气单胞菌感染大鲵后第3,5,7天的皮肤组织,提取其RNA,进行实时荧光定量PCR检测,应用3

为了探讨不同发育时期大鼠乳腺中雌激素受体α(Estrogen receptor,ERα)的表达情况,采用RT-PCR方法对不同发育时期大鼠乳腺组织中的ERα进行了半定量研究。结果表明,妊娠和泌乳期大鼠乳腺组织中的ERα表达水平均低于处女期,且差异显著(P0.05)。表明ERα可能参与了乳腺细胞的发育和凋亡。