【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐(inorganic phosphate,Pi)胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT(2.09%),最大的为LcTUA(6.8%)。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。

【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2170bp,开放阅读框为1737bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种...

以磷高效、耐铝毒的大豆双抗品种BX10为实验材料,采用1/5Hoagland营养液水培并进行低磷(-P)和铝毒(+Al)胁迫处理,收集胁迫后6 h、2 d和12 d的根叶材料,克隆大豆γ-ECS和hGSHS基因cDNA片段并测序验证,以大豆凝集素Lectin基因为内参基因,用半定量RT-PCR技术检测胁迫条件下大豆根和叶片中γ-ECS和hGSHS基因的表达情况,结果表明:低磷和铝毒胁迫均诱导了两个基因的表达,前期(2 d)增加幅度随着胁迫时间延长而增加,但胁迫后期(12 d)两个基因的表达在不同胁迫处理和组织间表现出不同的变化趋势,这些差异可能与胁迫的作用特性和hGSH合成酶的细胞定位有关。

【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1914bp,其中5′端非编码区25bp,开放阅读框为...

为筛选水稻参与氰化物胁迫响应的关键基因，采用Agilent4×44 K水稻全基因组芯片，分析了氰化钾和铁氰化钾胁迫下水稻幼苗叶片和根系的基因表达特征。结果表明：氰化钾和铁氰化钾处理下，从水稻根系中分别筛选到1841和3037个差异表达基因，从水稻叶片中分别筛选到734和1805个差异表达基因；氰化钾处理下，细胞壁代谢和抗逆相关的基因在根中显著上调表达；铁氰化钾处理下，水稻叶中解毒相关基因显著上调表达，说明氰化物能诱导水稻基因差异表达；与细胞解毒作用和抗逆相关的基因、与细胞壁和次生代谢途径以及转录因子类基因的表达均显著上调，表明2种氰化物处理下水稻根系和叶片均可能通过调节其体内的一些代谢途径和一些酶的催化活性来应对氰化物的胁迫，积极诱导与防御相关的基因，并通过主动吸收和转运等代谢过程将氰化物代谢解毒，以降低对植物的伤害。

【目的】谷子是一种耐旱作物,通过二代测序技术获得大量的谷子萌发期响应干旱胁迫的差异基因,进而挖掘谷子萌发期抵御干旱的关键基因及其相关的分子机制。【方法】以晋谷45为材料,谷子萌发期分别用18%PEG-6000干旱胁迫(处理组)和蒸馏水(对照组)处理种子并测定1、10和18 h种子的SOD、POD和CAT活性。SOD活性用氮蓝四唑(NBT)法测定,POD活性用愈创木酚法测定,CAT活性用比色法测定;对萌发10和18 h种子的对照组和处理组构建c DNA文库并进行差异基因表达谱分析;利用Bowtie将reads比对到参考基因组,采用RSEM对bowtie的比对结果进行表达量估计;使用DESeq进行差异表达基因分析;利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO在线数据库对差异基因进行功能注释,挖掘调控谷子萌发的关键基因;利用q RT-PCR验证测序结果的可靠性。【结果】处理组的SOD活性整体比对照组高,而POD活性和CAT活性与之相反;随着萌发时间的变化,SOD活性在不断地增加,但CAT和POD活性逐渐减小。基因表达谱序列与所选参考基因组序列高度一致,基因表达呈现出高度不均一性。通过高通量测序最后获得35 470个基因,以RPKM≥0.01为筛选标准,对照样本中分别筛选出24 030和24 486个表达基因,PEG干旱胁迫处理10和18 h的样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因;差异表达基因分析表明,谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因,其中87和267个上调表达基因,369和278个下调表达基因;GO功能显著性富集分析表明,差异基因主要涉及代谢过程,细胞进程和响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因参与到苯丙烷代谢和植物激素信号转导过程;通过q RT-PCR对5个差异基因在干旱胁迫下种子萌发时的表达分析表明,其表达趋势与表达谱分析结果基本一致。【结论】差异表达基因广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程;Sn RK2和PAL可能在干旱胁迫下调节种子的萌发。

为筛选水稻参与氰化物胁迫响应的关键基因，采用Agilent4×44 K水稻全基因组芯片，分析了氰化钾和铁氰化钾胁迫下水稻幼苗叶片和根系的基因表达特征。结果表明：氰化钾和铁氰化钾处理下，从水稻根系中分别筛选到1841和3037个差异表达基因，从水稻叶片中分别筛选到734和1805个差异表达基因；氰化钾处理下，细胞壁代谢和抗逆相关的基因在根中显著上调表达；铁氰化钾处理下，水稻叶中解毒相关基因显著上调表达，说明氰化物能诱导水稻基因差异表达；与细胞解毒作用和抗逆相关的基因、与细胞壁和次生代谢途径以及转录因子类基因的表达均显著上调，表明2种氰化物处理下水稻根系和叶片均可能通过调节其体内的一些代谢途径和一些酶的催化活性来应对氰化物的胁迫，积极诱导与防御相关的基因，并通过主动吸收和转运等代谢过程将氰化物代谢解毒，以降低对植物的伤害。

为了探明玉米重要自交系花粒期高温胁迫下转录组基因的表达差异,发掘玉米响应高温胁迫的关键基因和蛋白质,明确高温胁迫引起玉米减产的机理,从而利用分子生物学技术手段提高玉米耐高温胁迫性。首先,利用Ampha~(TM)Z30花粉活性分析仪检测高温胁迫和正常生长条件下玉米自交系昌7-2、郑58的花粉活性。然后收集花粉提取总RNA,利用Illumina Hiseq2000~(TM)高通量测序技术分别对昌7-2、郑58花粒期高温胁迫材料和正常生长条件下的对照材料进行全转录组测序,序列结果分析后获得差异显著表达基因。通过差异基因维恩图(VENN图)重叠区域分析、GO功能分类和富集统计、KEGG pathway通路分类和富集分析以及转录因子分析,获得玉米花粒期高温胁迫相关的重要差异表达基因和蛋白质。花粉活性检测结果显示,高温胁迫后和正常生长条件下,昌7-2花粉活性分别为24. 37%,42. 89%,郑58花粉活性分别为35. 57%,64. 83%。高温胁迫后在昌7-2花粉转录组中共检测到4 176个显著差异表达基因,郑58花粉转录组中共检测到5 487个显著差异表达基因。KEGG pathway通路分类和富集分析结果显示,高温胁迫后郑58的花粉转录组中有2 062个差异表达基因富集到399个相关通路上,昌7-2的花粉转录组中有1 943个差异表达基因富集到352个相关通路上。转录因子分析结果表明,共获得55个转录因子家族,其中,有45个转录因子包含10个以上差异表达基因。研究表明,通过对玉米自交系花粒期高温胁迫后花粉转录组测序获得了大量的差异显著表达基因信息,昌7-2、郑58对高温胁迫响应机制存在明显差异,热激蛋白(Hsps)、热激转录因子(Hsfs)、生长素(IAA)基因和磷脂酰基醇-4,5-二磷酸基因家族(PIP2)在响应玉米花粒期高温胁迫过程中起着重要作用。

利用Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｗｈｅＡｔ ｍｉｃｒｏＡｒｒＡｙ分析了郑麦９０２３在低磷和正常磷水培条件下，苗期根部基因在转录水平的差异。结果表明，１）筛选得到１ ８８９个差异表达基因，其中１ ２９８个上调表达，５９１个下调表达。２）基因功能分析显示，这１ ８８９个基因参与了信号转导、蛋白存储、逆境胁迫、能量代谢、病程相关和其他与植物生长发育有关的过程。３）利用ｑｒｔ－Ｐｃｒ对其中３０个基因的表达情况进行了验证，显示与基因芯片结果基本相同的表达趋势。４）在低磷及磷恢复条件下，对其中５个候选基因（ｔＡＳＰｘ３，ｔＡｉＰＳ１．３，ｔＡＧＳｔ＿Ｌｉｋｅ，ｔＡＰＤｆ１９，ｔＡＧ６ＰＤｈ１＿Ｌｉｋｅ）在不同小．．．

为探究泥鳅ELOVL1的功能和作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆泥鳅的elovl1基因,并分析elovl1基因的表达规律,最后将泥鳅分别暴露在26℃和8℃下饲养30d,研究低温胁迫对泥鳅脂肪酸组成、组织形态及elovl1基因表达的影响。结果发现:elovl1a全长为2 216bp,ORF为948bp,编码315个氨基酸;elovl1b全长为1 895bp,ORF为963bp,编码320个氨基酸。氨基酸序列特征如下:1个高保守的氧化还原组氨酸簇(HXXHH),多个跨膜区,氨基酸序列C端均含有内质网滞留信号(KXKXX)。elovl1a和elovl1b在所有组织中表达,elovl1a在每个组织的表达量均低于elovl1b。低温下总SFA明显降低(P<0.05),总MUFA显著增加(P<0.05)。低温显著诱导elovl1a、elovl1b表达。研究结果表明:泥鳅ELOVL1在脊椎动物中保守,ELOVL1可能在机体适应低温时,参与产生能量,起到重要的作用。

肿瘤坏死因子受体相关因子7 (tumor necrosis factor receptor associated factor7， TRAF7)作为一种细胞内蛋白，参与信号转导，并介导宿主应激防御调控过程。为研究TRAF7在刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)，克隆了刺参TRAF7 (AjTRAF7)全长cDNA序列，分析了其结构特征和在基因组中的分布，并检测了该基因在刺参不同组织和高温胁迫过程中体壁组织中的表达变化情况。结果显示，AjTRAF7全长2 576 bp，开放阅读框(ORF)长1 770 bp，5′UTR长345 bp，3′UTR长461 bp，编码589个氨基酸，预测蛋白分子量为65.6 kDa，理论等电点(pI)为7.52。蛋白序列包含1个RING finger结构域、1个Coiled coil结构域和6个WD40结构域，N端包含1个螺旋区域。该基因预测蛋白包含41个丝氨酸磷酸化位点、20个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点，蛋白N端具有3个天冬酰胺糖基化位点。刺参基因组中比对到2个AjTRAF7基因拷贝，位于同一条染色体上，第一个拷贝包含18个外显子和15个内含子，第二拷贝包含17个外显子和14个内含子。系统进化学分析表明，刺参TRAF7氨基酸序列与蝠海星(Patiria miniata)和紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)相似性较高，分别为40.58%和38.37%，刺参与蝠海星和紫色球海胆聚在一支。qRT-PCR结果显示，AjTRAF7在健康刺参各组织中均有表达，其在雌性性腺中表达量最高，体腔细胞中表达量次之，在呼吸树、体壁、肠道、雄性性腺和纵肌中表达量依次降低，各组织间表达量差异显著(P<0.05)。在响应高温胁迫的过程中，与对照组相比，体壁组织中AjTRAF7基因表达量在第2天和第4天表达显著上升(P<0.05)，第6天基因表达开始下降。综上，AjTRAF7基因可能参与刺参应对高温胁迫的表达调控过程，相关结果将为解析刺参应对高温胁迫的分子机制提供科学依据。

为了挖掘茎瘤芥响应盐胁迫和根肿菌胁迫过程中发挥功能的生长素响应因子基因(ARF),对进一步研究其在茎瘤芥抗逆过程中的基因功能提供依据。通过生物信息学方法对ARF家族基因启动子顺式作用元件进行分析,采用qPCR的方法对茎瘤芥ARF家族基因在不同器官以及盐胁迫和根肿菌胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,在ARF家族基因启动子上发现了多个响应生长素、盐胁迫和病原菌胁迫的顺式作用元件。BjARF1A和BjARF4B在叶中表达水平高,BjARF7C在根中表达水平高。在盐胁迫处理3 h后,BjARF1B和BjARF2B在根中受到强烈诱导表达;处理6 h后,BjARF9A和BjARF13E也受到显著诱导表达。在根肿菌处理条件下,相比于0 h对照,BjARF3A和BjARF3D分别在病原菌处理12,24 h后受到强烈的诱导表达;BjARF13B则在处理后持续下调表达且下调程度逐渐加强。综上所述,筛选到4个显著响应盐胁迫和3个显著响应根肿菌胁迫的ARF家族基因,为进一步研究其基因功能奠定了研究基础。

为研究大菱鲆过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)的组织分布和高温胁迫下PPARs在肾脏中的表达情况。实验采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测PPARs基因3种亚型在大菱鲆不同组织中的表达情况以及高温胁迫下大菱鲆肾脏中PPARs的表达情况。qPCR结果显示,大菱鲆PPARs 3种亚型的组织分布存在显著差异。PPARα1和PPARα2在心脏中的表达量显著高于其他组织;PPARβ在大菱鲆的各个组织中普遍表达;PPARγ在大菱鲆的鳃中出现了显著性的高表达。大菱鲆肾脏中PPARs的mRNA水平随着温度升高呈现出不同的响应模式。PPARα随温度升高表达水平先显著降低,后有所升高;PPARβ的表达量在14、20、23和25℃时差异不显著,当温度升高至大菱鲆的致死温度28℃时,表达量出现了显著性的升高;PPARγ在14℃时表达水平很低,但随着温度的升高不断增加。研究表明,大菱鲆中存在PPARα、PPARβ和PPARγ3种亚型,而且三者可能以组织特异性的方式参与脂质代谢的调节,首次指出PPARs 3种亚型在温度胁迫中的表达变化,对PPARs的研究将推动鱼类脂代谢研究,揭示鱼类PPARs在脂质代谢调控以及响应逆境胁迫中的重要作用。

【目的】研究黄瓜花叶病毒病(CMV)侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应。【方法】在结合气体交换和叶绿素荧光参数及抗性相关酶活性测定的基础上,应用农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室自主开发的黄瓜cDNA芯片研究黄瓜在CMV侵染胁迫下的基因表达谱变化,并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR(QRT—PCR)进行检测,以验证cDNA芯片杂交结果的可靠性。【结果】共获得67个差异表达显著的基因,其中42个基因下调表达,25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径。许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制;而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导...

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析，挖掘相关基因，并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析，借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系；采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因，开放阅读框序列长度为1 149 bp，共编码382个氨基酸，属于GDPD家族，其中存在一个保守结构域，名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根，中量表达于花和茎，微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后，立即会对低磷胁迫做出应答，胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因，获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式，为深入解析棉花GhGDPD1基因的生物学功能以及培育棉花磷高效利用新种质提供科学参考。图7表1参18