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[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙效文 贾智英 魏东旺 鲁翠云 梁利群
用2种方法克隆黑龙江鲤(Cyprinus(Cyprinus)carpiohaematopterus)的微卫星序列。这2种方法分别是:①经典的小片段DNA克隆库,用末端标记的[γ-32]ATP的CA重复序列为探针筛选;②将酶切获得的小片段DNA用结合有磁珠的并连接有15个CA重复序列的生物素进行富集,获得的含有CA重复的DNA片段并经过两次PCR扩增再克隆的方法获得富集微卫星片段的克隆库。从前一个方法的克隆库中筛选2000个菌落,获得阳性克隆45个,有22个含有微卫星,完美型的占63 6%,非完美型的占22 7%,混合型的占13 7%,重复次数超过10的有9个,占40 9%;从方法②的克隆库中筛...
关键词：
磁珠富集 小片段克隆 鲤 微卫星
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赵莹莹 朱晓琛 孙效文 梁利群
采用生物素—磁珠吸附微卫星富集法,筛选虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)微卫星分子标记,并用同位素法进行二次筛选。结果在筛选的192个菌落中获得136个阳性克隆,经测序分析,获得微卫星序列179个,其中完美型占50.8%,非完美型43.0%,混合型占6.1%。除探针中使用的CA重复外,还得到TC、AG、ACA、CTAT的重复序列。用引物设计软件Primer Premier5.0设计引物85对,挑选其中的40对合成并进行筛选
关键词：
磁珠富集 虾夷扇贝 微卫星
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
阮小凤 Gabi Krczal 杨勇
【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37....
关键词：
柿 微卫星 磁珠富集
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曹柱 鲁翠云 郑先虎 储志远 张天奇 赵元凤 孙效文
通过生物素磁珠富集法开发方正银鲫(Carassius auratus gibelio(Bloch))三、四核苷酸重复的微卫星,并与传统的放射性同位素杂交法相结合,进行二次筛选微卫星分子标记。结果显示:对652个阳性克隆进行测序分析,获得微卫星序列800个,其中完美型542个(67.75%),非完美型140个(17.50%),混合型118个(14.75%)。用引物设计软件primer3plus在线设计引物163对,选择合成76对,引物多态性通过二倍体野生鲫群体进行检测。检测结果显示,30对引物表现出不同程度多态性,等位基因数在3～8之间,多态信息含量(PIC)在0.4066～0.8023之间,其...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
胡磊 高丽 杨波
将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。
关键词：
花榈木 微卫星标记 磁珠富集 多态性
[期刊] 水产学报
[作者]
孙效文 鲁翠云 梁利群
磁珠富集法是一种快速、高效的分离微卫星分子标记的方法。本研究通过该方法分离草鱼的微卫星分子标记。将草鱼(Ctenopharyngodon idella)基因组DNA经Sau3AI酶切,回收纯化400～900bp片段,连上接头,构建“基因组PCR文库”。用生物素标记的简单重复序列(CA)15作探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,经一系列的洗涤过程,去除磁珠表面不含有微卫星的片段。将吸附在磁珠上的片段洗脱,PCR扩增放大,再进行克隆和测序,根据微卫星两端的保守序列设计引物,即可得到微卫星分子标记。本研究又通过同位素标记的探针(CA)15进行二次杂交筛选,获得阳性克隆132个,所...
关键词：
磁珠富集 草鱼 微卫星分子标记
[期刊] 水产学报
[作者]
全迎春 孙效文 刘伟 梁利群 鲁翠云
通过磁珠富集的方法分离大口鲶(Silurus meriaionalis)的微卫星分子标记。将基因组DNA酶切,梯度离心收集400~900bp片段并纯化,连接Brown接头,用生物素标记的寡核苷酸(CA)15作探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,然后将这些片段洗脱,PCR扩增,进行克隆构建“基因组文库”,再通过同位素标记的探针(CA)15进行2次杂交筛选,所得到的阳性克隆测序。从所获得593个阳性克隆中选取178个经测序,97.19%(173个)含有微卫星序列,90.60%重复数在10以上,75.98%为完美型。除探针中使用的CA重复单元外,还观察到CT、GA、ATG的重复序...
关键词：
大口鲶 微卫星 磁珠富集
[期刊] 水产学报
[作者]
徐鹏 周岭华 相建海
运用PCR法在中国对虾的小片段基因组文库中快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆。PCR中使用的引物为载体pGEM - 3zf(+)上多克隆位点两侧的T7/Sp6启动子引物和根据微卫星核心重复序列设计的STR引物 :STR1:5’ -ATATATATATATAT - 3’ ;STR2 :5’ -TCTCTCTCTCTCTC - 3’。直接使用含有重组克隆的菌液 ,在PCR反应前增加一段裂解细菌的高温。筛选出来的含有微卫星序列的重组阳性克隆经DNA测序验证。结果证明 ,采用PCR方法用菌液快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆完全可行 ,而且具有简便、快速、高效、不涉及同位素操作等优点
关键词：
中国对虾 微卫星 聚合酶链式反应
[期刊] 水产学报
[作者]
战爱斌 胡景杰 胡晓丽 王明玲 彭薇 李艳 李纪勤 包振民
应用微卫星富集文库—菌落原位杂交法,筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记。用固定了(AG)15和(AC)15探针的尼龙膜(Hybond N+)捕捉含有微卫星DNA的片段,经洗脱、PCR扩增和TA克隆,构建栉孔扇贝的微卫星富集文库。利用ECL试剂盒(Amersham公司)标记的(AG)15和(AC)15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库,阳性克隆经测序获得微卫星DNA。富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后,532个(44.3%)为阳性克隆。任意挑选100个克隆测序,结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点。利用软件设计了65对特异性PCR引物,40对能扩增出清晰的带谱;利用48个...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郝君 孙效文 梁利群 鲁翠云
根据生物素与链霉亲和素的亲和原理,采用生物素-磁珠富集微卫星,与传统放射性同位素杂交法相结合,构建筛选大黄鱼的微卫星文库。用生物素-微卫星捕捉单链限制性酶切片段(含有接头和大黄鱼微卫星序列),经PCR扩增单链目的片段形成双链,然后连接至T载体上,转化感受态细胞。将移至硝酸纤维素膜的重组菌用32P标记的放射性同位素探针5′-[γ-32PATP(CA)15筛选出阳性克隆菌。测序结果发现,阳性克隆率为71.9%,105个微卫星位点。其中选取设计合成30对并筛选出22对可用引物。说明所建大黄鱼微卫星文库是一个高质量的文库,可为大黄鱼基因组结构分析、大黄鱼精密微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、...
关键词：
大黄鱼 微卫星 磁珠 生物素
[期刊] 水产学报
[作者]
宋春妮 李健 刘萍 陈萍 高保全
采用磁珠富集法筛选日本蟳微卫星分子标记。日本蟳基因组DNA经Sau3 AⅠ酶切后,收集400～1 200 bp大小的片段并纯化,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)15从中筛选出含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的基因组文库,经PCR检测筛选出阳性克隆进行测序。从随机挑选的970个菌落中筛选出369个阳性克隆进行测序,结果86.99%(321个)含有微卫星序列,其中完美型占80.54%,非完美型占15.95%,混合型占4.28%。除使用的探针AC重复外,还得到GA、CT等重复序列。共设计出102对微卫星引物,其中65对能扩增出清晰条带,27对具有多态性。...
关键词：
日本蟳 微卫星 磁珠富集法
[期刊] 水产学报
[作者]
贾舒雯 刘萍 韩智科 李健 潘鲁青
采用人工合成的生物素标记(AG)15探针及磁珠富集法构建了脊尾白虾基因组微卫星富集文库。将脊尾白虾基因组DNA经HaeⅢ酶切后,收集400～1 200 bp片段,连接特定接头,与生物素标记(AG)15探针杂交并捕获含有微卫星的DNA片段,然后连接到pMD18-T载体中,构建脊尾白虾微卫星富集文库。随机挑取947个克隆,经菌落PCR检验,其中667个为阳性克隆。从阳性克隆中随机选取184个克隆进行测序,有150个克隆含有微卫星序列,共获得199个微卫星序列,其中完美型158个(79.4%),非完美型27个(13.6%),复合型14个(7.0%)。根据微卫星序列,设计了119对微卫星引物,64对扩...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
匡刚桥 刘臻 鲁双庆 刘红玉 张建社 唐建洲
通过FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)法构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。鳜鱼基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,选取200~800 bp的片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建鳜鱼基因组微卫星富集...
关键词：
鳜鱼 微卫星标记 富集文库
[期刊] 水产学报
[作者]
董仕 谷口顺彦
实验应用微卫星DNA检测技术,分析了Ⅰ至Ⅶ组共42尾香鱼的Pal-1 和Pal-2 两个基因座位的基因型。结果显示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ组共22尾在两个基因座位上均为纯合,是基因型完全相同的克隆鱼,并且Ⅶ组10尾为人工诱导成功的雌核发育二倍体,而Ⅰ为混入本克隆的其它类型的香鱼;Ⅴ组9尾为Ⅰ与海产香鱼的子代;Ⅵ组10尾为Ⅱ或Ⅲ与海产香鱼的子代。
关键词：
香鱼 克隆 微卫星DNA
[期刊] 中国水产科学
[作者]
佟广香 鲁翠云 匡友谊 梁利群 尹家胜 孙效文
采用磁珠富集法构建哲罗鱼(Hucho taimenPallas)基因组微卫星文库。哲罗鱼基因组DNA经MboI限制性内切酶消化后,选取400~900 bp的片段,用生物素标记的简单重复序列(ACA)15作探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,获得目的片段,连接T载体克隆,构建基因组微卫星富集文库。再用同位素标记的(ACA)15探针进行二次筛选,筛选出686个阳性克隆,阳性克隆率为35.94%。对其中140个阳性克隆进行测序,共获得149个微卫星序列,4个小卫星序列,其GenBank Accession Number为DQ110955~DQ121108。其中perfect(完美...
关键词：
哲罗鱼 微卫星 磁珠富集
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