为获得高效抗除草剂的基因,提高转基因作物的应用能力,本研究使用含硝磺草酮的酪氨酸无机盐培养基(TMSM)平板筛选法,筛选得到一株能够耐受5 000μmol/L硝磺草酮的革兰氏阴性细菌MST-5,经过16S rRNA序列分析鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。根据4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)同源基因设计引物,从MST-5中克隆到编码HPPD的基因Sthppd,序列分析发现Sthppd序列长度为1 071bp,编码356个氨基酸。同源比对发现,St HPPD与已报道的HPPD相似性仅为47%～51%。在大肠杆菌中进行原核表达Sthppd并通过Co2+亲和层析纯化获得St HPPD纯蛋白,活性检测表明此蛋白具有4-羟苯基丙酮酸双加氧酶活性,抗性分析显示其对硝磺草酮具有较高的抗性,IC50为15.5μmol/L,同时对其它HPPD抑制剂类除草剂如苯吡唑草酮和二酮腈也有较强抗性,IC50分别达到10.8和28.2μmol/L。St HPPD的最适反应温度为30℃,最适pH为7.0,大部分金属离子和某些化学添加剂严重抑制St HPPD的活性,Fe3+、Mg2+和Urea对St HPPD酶活基本没有影响。综上,St HPPD具备较高硝磺草酮抗性,在构建抗除草剂转基因作物、与HPPD抑制剂类除草剂搭配在相关转基因作物的田间应用中,具有一定价值。

通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产...

【目的】克隆稗草(Echinochloa crus-galli)乙烯生物合成途径关键酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(Ec ACO),对其进行表达分析和酶活性测定,以探究稗草抗二氯喹啉酸的机理。【方法】根据转录组测序所得Ec ACO部分序列设计引物,分别从二氯喹啉酸的抗性和敏感型稗草中克隆Ec ACO的全长序列,用DNAman以及Gene DOC等软件进行序列分析。用q RT-PCR方法分析抗性和敏感性稗草间的Ec ACO表达水平差异。最后分别将抗性和敏感性稗草Ec ACO的开放阅读框(ORF)序列连接至原核表达载体p MAL-c5x中,并转化至大肠杆菌菌株BL21,经终浓度为0.4 mm...

利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵紧密连锁的原理,在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上,从205个新鲜的牛奶样品中定向筛选乳链菌肽抗性菌株。对筛选到的4株菌分析鉴定结果表明:4株菌均为革兰氏阳性菌,产乳酸,过氧化氢酶试验阴性;通过质粒的抽提和电泳,发现Lactococcuslactissubsp.lactisZL2009,ZL2010,ZL2024,ZL2030分别含有1,7,5,3条质粒带,且4株菌的质粒DAN分子大小不完全相同。

天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白。本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析。该基因cDNA序列全长为3 158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白。该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM)。草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间。草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3′末端非翻译区(UTR)和5′UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IR...

绝大多数观赏山茶花属于设施栽培植物,因环境湿热易造成病虫害出现,导致观赏价值降低,影响种植效益。为了提高抗虫性,根据山茶同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3',5'-RACE技术,从杜鹃红山茶嫩叶组织中克隆出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine proteinase inhibitor,CPI)基因,命名为Ca CPI,基因全长579 bp,开放阅读框306 bp,编码101个氨基酸,分子量为11.078 k Da,等电点p I=6.72。利用实时荧光定量PCR方法对杜鹃红山茶根、茎、叶中该基因的表达特性进行分析,结果表明,Ca CPI基因在叶中的表达量较高,其次为茎,在根中表达量较低,...

为进一步研究ＪｓＷＲＫＹ１的生物学功能，构建ＪｓＷＲＫＹ１的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。ＪｓＷＲＫＹ１过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因ＭｎｓＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ｓＯＤ、Ｃｎ、ｎＡＤＰＨ ＯｘｉＤＡｓｅ和ＰＲ１的转录水平。与野生型烟草相比，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外，用胶孢炭疽．．．

通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。

【目的】以烟草(NC-82)为试验对象,运用组织培养方法,通过对苯磺隆对烟草愈伤组织抗性发展的影响、对愈伤组织生长的影响、对愈伤组织分化率的影响、对愈伤组织乙酰乳酸合成酶活性的影响和抗性筛选再生烟草苗抗性潜势进行较系统的研究,以期对ALS抑制剂类除草剂的抗性研究和科学合理使用以延缓抗药性的发生,以及对作物的抗性育种提供一定的理论依据。【方法】将烟草诱导产生的胚性愈伤组织在含有不同剂量磺酰脲类除草剂苯磺隆的MS培养基上继代培养进行抗性诱导,并对愈伤组织的生长情况及其ALS对苯磺隆敏感性进行跟踪检测;对抗性筛选再生烟草苗进行抗性检测。【结果】随着培养代数的增加,愈伤组织对苯磺隆的抗药性逐渐增强,经...

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein ...

分别从不能出菇的草菇单孢菌株PYd21(基因组测序菌株)和PYd15(重测序菌株)及由PYd21、PYd15配对杂交获得可正常出菇的异核菌株H15-21中克隆测序了磷酸丙糖异构酶(TPI)基因,并对TPI基因的结构及其在3个菌株中的表达量进行了分析.结果表明:PYd21、PYd15中TPI基因的序列完全相同;转录组读段定位、双末端分析结果显示,TPI基因全长1015 bp,开放阅读框序列全长756 bp,编码251个氨基酸,有6个外显子、5个内含子;RNA加工过程中存在两种可变剪切类型和两个可变剪切位点;数字基因表达谱测序的结果表明,PYd21、PYd15和H15-21中TPI基因的表达量(T...

为了探究盐胁迫下不同抗性水稻氮代谢的变化,以抗性品种东稻4号、盐敏感品种日本晴为材料,测定NaCl胁迫下水稻根和叶中氮含量、氮代谢相关酶活及相关基因表达的变化。结果表明,0.3%的NaCl胁迫后水稻根和叶中NO~-_3含量、硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、依赖NADH的谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)活性均有不同程度的下降,而NH~+_4含量、依赖Fd的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性均升高,东稻4号氮含量及氮代谢酶活性比日本晴稳定,根和叶中变化一致。检测氮转运及代谢相关基因表达发现,硝酸根转运蛋白基因OsNRT1;1、OsNRT1;5、OsNRT1;8、OsNRT2;1,铵转运蛋白基因OsAMT1;1、OsAMT1;2及谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2、天冬氨酸转氨酶基因OsAS盐胁迫后在2个品种中均升高,在高表达部位升高显著;谷氨酸合酶基因OsFd-GOGAT在两品种叶中升高显著,根中稍有下降;谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和谷氨酸脱氢酶基因OsGDH在日本晴根中升高显著,在叶中及东稻4号中升高但不显著。OsNR1在NaCl胁迫后两品种叶中表达量显著降低,根中无差异。东稻4号OsNRTs及氮代谢相关基因表达量总体上高于日本晴,而日本晴OsAMTs升高幅度大于东稻4号。研究表明,NaCl胁迫下,东稻4号相比日本晴更能保持氮代谢稳定性,这可能是水稻抗性品种耐盐的一个重要机制。

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001...

【目的】Lon1蛋白酶具有降解叶绿体和线粒体内氧化蛋白、维持细胞正常代谢的功能。在分析蓝莓VcLon1时空表达模式的基础上,利用烟草遗传转化技术结合干旱生理分析,揭示蓝莓VcLon1的生物学功能,为运用生物技术培育蓝莓抗旱品种提供理论基础,并为其他植物抗旱机制研究提供基础信息。【方法】在从南高丛蓝莓‘夏普蓝’中克隆得到VcLon1全长(Gen Bank登录号:MF972079)的基础上,利用DNAMAN、MEGA4.0、Wo LF PSORT和Protparam等生物信息学软件及在线程序预测VcLon1序列及蛋白结构特征,分析比对氨基酸序列同源性并构建其同源蛋白序列进化树;同时,采用实时荧光定量PCR分析蓝莓VcLon1在不同组织及干旱条件下的表达模式;最后,构建表达载体,遗传转化本氏烟,以野生型、VcLon1超表达这2种基因型本氏烟为材料,进行干旱处理并分析二者在生物量生长、光合生理及氧化胁迫水平等方面的差异。【结果】1)PCR扩增得到VcLon1的ORF序列长2 982 bp,该序列编码993个氨基酸,预测蛋白的理论等电点为5.44,分子量为109.5 kDa。VcLon1编码的蛋白序列含有1个典型的AAA+结构域,属于AAA+超家族,定位分析编码蛋白在叶绿体和线粒体中表达,该蛋白与葡萄、苹果等Lon1蛋白酶亲缘关系较近。2)利用实时荧光定量PCR对VcLon1的表达量分析,发现其在‘夏普蓝’蓝莓各组织中均有表达,老叶中的表达量显著低于嫩叶,干旱胁迫显著提高蓝莓VcLon1的转录水平。3)干旱胁迫下各株系本氏烟生长均受到抑制,但VcLon1超表达植株均较野生型生长健壮,其中又以VL-6长势最佳,其叶片未发黄且根系发达,其株高、干质量分别比野生型高36.66%、114.29%。4)干旱胁迫下野生型本氏烟叶绿体肿胀明显且部分基粒片层结构模糊,分层不明显,而VcLon1超表达本氏烟仅部分叶绿体基粒片层空隙增大,其叶绿体超微结构未出现明显损伤,且叶片叶绿素含量高于野生型。同时,野生型本氏烟胞内线粒体普遍出现肿胀、变形,嵴断裂、解体并空泡化的现象,而VcLon1超表达本氏烟的线粒体仍维持正常椭球形。5)在氧化胁迫水平方面,VcLon1超表达植株干旱胁迫下的MDA含量均比野生型低34.38%~49.68%,且其叶片中H2O2的积累也较低,而野生型叶片的褐色面积明显上升。羰基化蛋白含量也呈现相似的变化趋势,VcLon1超表达本氏烟比相同条件下的野生型低36.89%,这可能由于VcLon1超表达植株各株系中SOD、GR、APX及POD等抗氧化酶的活性普遍显著高于野生型所致。【结论】干旱胁迫下,南高丛蓝莓‘夏普蓝’内VcLon1的运作机制可能是通过维护细胞膜系统及叶绿体的正常形态结构,同时通过降解线粒体内羰基化蛋白质,使线粒体结构保持完整、能量代谢等功能得以正常维护,减少活性氧自由基(ROS)的产生及维护抗氧化酶类活性,从而有效地降低细胞器内ROS的产生与积聚,并最终降低胞内的氧化胁迫水平,维持正常植物代谢,提高其抗旱能力。

【目的】核转录因子Y(nuclear transcription factor Y,NF-Y)属于一类广泛存在于真核生物中的转录因子基因家族,参与植物生长发育、胁迫响应等过程,但其参与低氮胁迫响应的研究尚未报道。从抗旱及耐瘠薄的谷子中分离出一个新的NF-Y类转录因子基因Si NF-YA6,对其表达模式和生物学功能进行分析。【方法】通过对谷子低氮处理前后的转录组差异表达谱分析,鉴定出一个受低氮诱导表达明显上调的的NF-Y类转录因子A亚基基因Si NF-YA6。利用DNAMAN和MEGA6.0软件对Si NF-YA6进行系统进化树分析;通过Real-time PCR方法分析Si NF-YA6在不同...