以PK15细胞为模型,研究不同浓度的硒蛋氨酸对猪细小病毒(PPV)体外复制的抑制作用。结果表明,在2～8μmol·L-1范围内,硒蛋氨酸对细胞生长没有影响,但对猪PPV的体外复制呈现显著的抑制作用(P<0.05),且随着浓度的增加其抑制作用增强。还原型谷胱甘肽和甘露醇均有增强硒蛋氨酸的抑制病毒复制作用,两者同时添加时,其作用更明显。

【目的】为探讨连翘苷等６种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）的作用机制，明确其体外抗病毒作用效果，为抗ＴＧＥＶ的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术，采用ＭＴＴ比色法和细胞病变（ＣＰＥ）观察法相结合，测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚６种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ＳＴ）的毒性作用，通过观察细胞ＣＰＥ情况，确定药物对细胞作用的最大安全浓度；同时测定病毒的ＴＣＩＤ＿（５０），用细胞维持液配成１００·ＴＣＩＤ＿（５０）病毒悬液备用；将６种药物在最大安全浓度范围内连续２倍倍比稀释后，分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞３种不同作用方．．．

[目的]探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。[方法]采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。[结果]pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的基因的mRNA表达量均极显著降低(P<0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P<0.01或P<0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P0.05)。[结论]pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。

采用滤纸片扩散法和二倍稀释法测定金线莲不同方法提取物对6种供试菌的体外抑菌效果,并利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定金线莲水提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖的影响.结果表明:3种提取方法所获得的金线莲提取物均对链球菌有较强抑制作用,表现为高敏;对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌表现为中敏;对酵母菌和普通变形杆菌的抑制作用不明显,表现为低敏.最小抑菌浓度均不高于12.5 g.L-1.药物与病毒混合组对NDV的抑制率显著高于先病毒后药物组和先药物后病毒组(P<0.05).药物浓度与NDV抑制率存在明显的正相关(P<0.05).在先药物后病毒组和药物与病毒混合组中,15.62-31....

将不同质量浓度 (0 3、 0 5、 0 6、 0 8、 1 0、 1 2、 1 5和 2 0 μg·mL-1)的亚硒酸钠加入大鼠的肝癌细胞 (RH 35 )和正常肝细胞 (BRL)的体外培养液中 ,分别在不同时间 (2 4、 4 8、 72和 96h ;2 4、 5 6和 96h)检测肝癌细胞和正常肝细胞的活性、增殖能力、生长曲线等指标。结果表明 ,随着浓度和时间增加 ,亚硒酸钠对肝癌细胞的生长抑制作用逐渐增强 ;随时间的延长 ,亚硒酸钠对正常肝细胞的生长呈现一定的抑制作用 ,但浓度变化对正常肝细胞生长抑制的作用不明显。

探讨连翘苷对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)增殖及对炎症相关细胞促炎因子和趋化因子基因表达水平的影响.采用噻唑蓝(MTT)法检测连翘苷对鸡胚成纤维细胞DF-1的安全质量浓度为0～125.00μg·mL~(-1),并筛选出最佳的给药方式为：先感染病毒再给药连翘苷.采用半数组织培养感染剂量(TCID_(50))检测MDRV在DF-1细胞中的增殖情况，结果表明，给药24～48 h时，连翘苷能使MDRV滴度极显著下降(P<0.05).综上，连翘苷能抑制MDRV在DF-1细胞中的增殖，并降低细胞炎症因子基因的表达水平，具有良好的抗病毒和抗炎的双活性.

研究虎杖、石榴皮、大黄、黄芩、五倍子、黄连、冬凌草、独活、贯众、木贼草等10种中药材单用和五倍子、大黄、石榴皮、虎杖、黄芩、黄连两两联用(15种配方)对从养殖病鳗中分离得到的12株常见病原菌的抑菌作用。结果表明:中药单用对病原菌均有不同程度的抑制作用,其中,五倍子的抑菌作用最强,其次是大黄和石榴皮,木贼草的抑菌作用最差;中药联用呈现协同效应(FIC<1)的占68.3%,其中有显著协同效应(FIC≤0.5)的占26.0%,与中药单用相比,中药联用对大多数病原菌的抑制作用增强,且可大大减少单一中药的给药浓度。

【目的】制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性。【结果】通过间接免疫荧...

【目的】探究bta-miR-33b对牛前体脂肪细胞分化的作用,并对此过程中潜在的靶基因进行验证。【方法】分离培养秦川牛前体脂肪细胞并进行诱导分化,PCR检测bta-miR-33b在前体脂肪细胞分化过程中的时序表达。对牛前体脂肪细胞体外转染bta-miR-33b的mimic、mimic negative control (mimic NC)、inhibitor、inhibitor negative control (inhibitor NC)进行诱导分化培养,于分化培养的不同时间取样,检测脂肪细胞分化标志基因(过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因)的mRNA表达量及甘油三酯和脂滴含量。预测bta-miR-33b的靶基因,并通过双荧光素酶报告系统验证靶向关系、Western Blot检测靶蛋白的表达量。【结果】在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b的表达量呈下降趋势。在前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b mimic可抑制脂肪分化标志基因的表达,降低细胞中甘油三酯和脂滴的含量; bta-miR-33b inhibitor可促进脂肪分化标志基因的表达,提高甘油三酯和脂滴的含量。高迁移率族蛋白A2(High mobility group AT-hook 2,HMGA2)基因、扭曲相关蛋白(Twist family bHLH transcription factor 1,TWIST1)基因是bta-miR-33b的靶基因;脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b能够调控HMGA2和TWIST1蛋白水平的表达。【结论】bta-miR-33b对秦川牛前体脂肪细胞体外分化具有抑制作用;HMGA2和TWIST1是bta-miR-33b的靶基因。

体外试验研究瘤背石磺多糖(Onchidium reevesii polysaccharides, OSP)和硫酸酯化修饰后瘤背石磺多糖(Sulfated Onchidium reevesii polysaccharides, S-OSP)对人宫颈癌Hela细胞生长的影响，并以阳性药物顺铂(0.5、0.75、1.5μg/mL)作为对照。将不同质量浓度(50、75、150μg/mL)的OSP和S-OSP作用于Hela细胞，用CCK-8法分析Hela细胞在12、24、48和72 h的增殖情况，用流式细胞仪分析细胞周期，并应用qRT-PCR检测相关凋亡基因的表达变化。结果表明，OSP和S-OSP均能降低Hela细胞活性并诱导其凋亡，而且S-OSP比OSP更能显著抑制Hela细胞增殖活性，表明硫酸酯化修饰改变了多糖结构进而影响多糖抗肿瘤活性。作用48 h后，3种质量浓度OSP组Hela细胞生长抑制率分别为60%、67%和71%;S-OSP组Hela细胞生长抑制率分别为74%、77%和84%;顺铂组Hela细胞生长抑制率分别为82%、86%和90%。流式细胞术检测显示OSP和S-OSP作用24 h后，细胞早期和晚期凋亡的比率显著，G0/G1期细胞比例增多，S期细胞比例不断降低；实时荧光定量表明促凋亡基因Caspase-3的表达量随药物质量浓度的提高显著增加，抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL的表达量随药物质量浓度的提高无明显变化，说明OSP和S-OSP可通过调节Caspase信号通路诱导Hela细胞凋亡。

【目的】筛选出对黄瓜花叶病毒(CMV)具有抑制作用的真菌多糖。【方法】采用半叶枯斑法和盆栽试验,测定了猴头菇多糖、云芝多糖、安络小皮伞多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、猪苓菌多糖、黑木耳多糖、虫草多糖、香菇多糖和蜜环菌多糖等10种真菌多糖对CMV的室内抑制效果和对烟苗生长的影响;采用间接ELISA以及病情指数调查法,分别测定了云芝多糖对烟苗叶片内CMV含量的影响及对CMV的田间防效。【结果】不同质量浓度真菌多糖对CMV均有一定的抑制作用,抑制效果随着多糖质量浓度的增加而提高,在不同处理中,真菌多糖对CMV的预防效果最好,其次为钝化效果。1 000mg/L的云芝多糖对CMV具有良好的预防作用,防效高达...

【目的】筛选对烟草花叶病毒(TMV)有良好抑制作用的多糖。【方法】采用半叶法,测定了云芝、金针菇、姬松、杏鲍菇、双孢蘑菇、灵芝、猪苓菌、蜜环菌、黑木耳、虫草、白桦茸和平菇等12种真菌多糖在枯斑三生烟(Nitcotiana tabacumvar.Samsun NN)上对TMV的抑制作用,并测定了其对烟草(普通烟NC-89)生长的影响。【结果】云芝多糖、猪苓菌多糖、虫草多糖和蜜环菌多糖对TMV均有较好的抑制效果,其中1g/L云芝多糖对TMV具有良好的预防作用,提前48h多糖处理的预防效果高达92.12%。云芝多糖对烟草具有促生作用,1g/L云芝多糖处理烟苗的地上部鲜质量和最大叶面积增效最为显著,分...

【目的】探讨灰树花水溶物(GFWE)的化学成分及其对EV71病毒的抑制作用，为促进灰树花综合利用、提高其经济附加值，以及开发预防和治疗EV71病毒感染的功能性食品提供依据。【方法】采用色谱法测定了GFWE的主要化学成分组成、多糖组成和分子质量。基于体外细胞培养采用CCK-8法确定了GFWE的安全上样量；以EV71病毒感染Vero细胞为模型，探究GFWE对EV71病毒的抑制率及对Vero细胞形态的影响，并采用荧光定量PCR检测了EV71病毒衣壳蛋白(VP1)编码基因mRNA的表达水平，初步评价了GFWE对EV71病毒的抑制作用。【结果】GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成。GFWE富含的13种氨基酸中包含7种必需氨基酸；其多糖由葡萄糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖和古罗糖醛酸4种单糖组成，物质的量比为0.907∶0.038∶0.029∶0.026,重均分子质量分别为15.67、10.10、6.60 ku和<1.00 ku。GFWE表现出较高的抗EV71病毒活性，100、200μg·mL~(-1) GFWE对EV71病毒的抑制率分别为91.32%、91.83%,25～400μg·mL~(-1) GFWE能显著降低EV71 VP1 mRNA的表达水平。【结论】GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成，具有较高的抗EV71病毒活性，能够抑制感染EV71病毒的Vero细胞中VP1的合成。

旨在探讨番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)之间的互作关系。根据GenBank中已发表的北京鸭和浙东白鹅eEF1A1基因序列,经大肠杆菌偏爱密码子优化,人工合成的质粒分别命名为pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1;对含有MDPV YL08株NS1基因的重组质粒pUC57-NS1、pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收目的片段后分别插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a中,构建了重组质粒pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1;重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的表达;采用HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-DeEF1A1、HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-GeEF1A1;采用HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-NS1、HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-NS1,采用MDPV感染番鸭血清鉴定TRX-NS1和GST-NS1的抗原性;采用GST pull-down试验验证GST-DeEF1A1与TRX-NS1、GST-NS1与TRX-GeEF1A1的互作。结果表明,获得的重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的分子量分别为76.9,67.9,89.5,98.6 ku; GST-DeEF1A1和GST-NS1可与HRP标记的GST单克隆抗体特异性结合,TRX-GeEF1A1和TRX-NS1可与HRP标记的His单克隆抗体特异性结合;GST-NS1和TRX-NS1可与MDPV感染番鸭血清特异性结合,抗原性良好;GST pull-down试验中,GST-DeEF1A1可与TRX-NS1互作,GST-NS1不与TRX-GeEF1A1互作。本研究表明,MDPV NS1蛋白可以和北京鸭eEF1A1在体外相互作用而不能和浙东白鹅eEF1A1在体外相互作用,互作结果差异性可能与二者的102-106 aa, 108 aa的氨基酸残基有关。

从发病濒死的虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)蝌蚪中分离到一种病毒。在25℃条件下,该病毒能在鲤鱼表皮瘤细胞系(EPC),胖头肌肉细胞系(FHM)和草鱼性腺细胞系(CO)三种鱼类细胞上产生空斑状的细胞病理变化(CPE)。该病毒对氯仿,热(56℃,30min)和酸(pH3)敏感。其体外培养的适合增殖温度范围为20～30℃。 电镜下观察,病毒为对称的二十面体,切面正六边形,对角直径125nm左右。