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[期刊] 林业科学研究
[作者]
刘明英 乔桂荣 蒋晶 邱文敏 卓仁英
以筛选出的镉超积累矿山型东南景天为材料,经镉胁迫后提取总RNA,纯化mRNA,利用改良SMART技术合成了全长cDNA,回收500 bp以上cDNA大片段克隆到改造过的大肠杆菌/酵母穿梭载体pYES2.0G中,建成东南景天镉全长cDNA文库,对随机挑取的阳性克隆进行PCR鉴定,插入片断大小在1 000 bp左右,说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的建库要求,为将来筛选克隆与东南景天抗重金属相关基因奠定了基础。
关键词：
东南景天 cDNA文库 耐镉 酿酒酵母
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李有全 罗建勋 高金亮 关贵全 马米玲 刘志杰 刘军龙 刘爱红 任巧云 党志胜 鲁炳义 刘光远 白启 殷宏
【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨丽鸳 朱梦奕 何璟
为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制，以链霉菌整合型质粒ｐＪＴＵ２５５４为载体，构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主，通过生物活性筛选获得９株具有抑菌活性的异源表达突变菌株，同时通过ｐＣＲ筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。ＴＬＣ及ＨｐＬＣ－ＭＳ分析发现６个携带有ａＵＲｅｏＴＨｉｎ生物合成基因簇的ＣｏＳＭｉｄ，通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素ａＵＲｅｏＴＨｉｎ，证实文库异源表达及筛选的有效性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘光远 田占成 才学鹏 李知新 谢俊仁 王路 张林 龚真莉
【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank...
关键词：
长角血蜱 卵 cDNA表达文库 构建
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
赵婷 韩小娇 刘明英 乔桂荣 蒋晶 姜彦成 卓仁英
铁蛋白(ferritin)是一种专门存储铁的重要胁迫相关蛋白,参与镉离子吸收的调控。从构建的东南景天Sedum alfredii c DNA文库中筛选出东南景天Ferritin基因c DNA全长,命名为Sa Fer,编码序列为1 117 bp,开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸。以东南景天基因组DNA为模板分离到Sa Fer基因组序列,长度为1 702 bp,含有7个内含子。氨基酸序列同源性分析表明:Sa Fer与苹果Malus domestica Ferritin亲缘关系最近,同源性高达76%。实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)分析发现:根系中Sa Fer基因在镉胁迫1...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李雯 郭巍 张霞
昆虫围食膜是由几丁质和蛋白质组成一个半透膜结构,由中肠分泌,保护细胞免受机械性损伤和细胞微生物感染。以害虫生物防治的新靶标——中肠围食膜作为研究对象,分离和鉴定甜菜夜蛾中肠围食膜蛋白基因。依据免疫学筛选方法,用制备的甜菜夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体,对甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库进行免疫筛选。获得231个围食膜蛋白阳性克隆,经测序、生物信息学分析可知得到8个几丁质结合蛋白,2个肠粘蛋白;并对结构功能进行分析预测。研究结果为揭示围食膜分子结构,进一步以中肠围食膜为靶标进行生物防治奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李杰 张霞 郭巍 刘小民 李新娜 赵丹
昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致死亡。本研究提取棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)围食膜蛋白,成功制备棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,并对棉铃虫中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,共得到385个阳性克隆。对其中26个克隆进行鉴定并测序分析,结果表明19个克隆为肠粘蛋白。过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测棉铃虫围食膜蛋白组成,发现围食膜蛋白大部分为糖蛋白。通过对棉铃虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为进一步分析棉铃虫围食膜蛋白的生理功能,寻找生物防治新靶标,开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
冯童禹 乔桂荣 蒋晶 邱文敏 韩小娇 卓仁英 刘明英
[目的]对超积累型东南景天ABC转运蛋白家族成员Sa12F279开展生物信息学分析及表达分析,为探究ABC类转运蛋白在镉、干旱、盐碱等非生物胁迫中的功能提供参考。[方法]通过对超积累型东南景天转录组数据库进行比对分析,获得1个ABC家族成员的基因。通过生物信息学方法分析Sa12F279基因的进化关系、蛋白结构域构成、核心结构域同源比对及在组学数据中相关的互作蛋白分类;借助实时定量PCR技术分析该基因在盐碱、干旱及ABA激素胁迫下根中的表达变化。[结果]通过比对分析获得ABC家族成员Sa12F279基因,该基因的开放阅读框长度为4 497 bp,编码蛋白长度为1 498个氨基酸,相对分子量为167.1 KD,等电点为6.92。进化分析显示:Sa12F279基因与C亚类成员聚为一簇,且在结构域构成上符合ABC家族的保守排布。共表达网络分析显示:Sa12F279与567个基因存在功能上的关联,对这些基因进行功能注释发现,其中39.8%的基因执行代谢相关功能,29.3%的基因与细胞内进程相关,10.2%的基因涉及生物调控,7.1%的基因参与转运活性。对镉胁迫前后转录组数据分析显示,Sa12F279基因在根、茎、叶3种组织中,取样点24 h和96 h的表达量均呈现对镉胁迫下调响应。实时定量结果显示:该基因对ABA激素、盐碱和干旱不同胁迫的应答模式存在差异,且应答响应较平缓。在ABA激素处理下,呈现先下调后上升的趋势;在盐胁迫下,呈现早期响应不显著而于胁迫后期出现上调应答;在干旱处理下,呈现先升后降又升的趋势。[结论]鉴定了超积累型东南景天ABC家族的1个Sa12F279基因,揭示了该基因在不同非生物胁迫下的表达模式。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘培 俞燕飞 陶美凤
灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李梦辉 刘连瑞 涂浩 黄经纬 张振超 徐立新 严若峰 李祥瑞 宋小凯
[目的]为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因,利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。[方法]首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA并分离纯化mRNA,用Clone MinerTMⅡcDNA文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库,然后将cDNA从初级文库重组到p VAX1.0上,构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,最后用7个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。[结果]构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库总容量为0.92×107CFU,插入片段平均大小为1.63 kb;表达文库总容量为2.32×107CFU...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李梦辉 刘连瑞 涂浩 黄经纬 张振超 徐立新 严若峰 李祥瑞 宋小凯
［目的］为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因，利用ｇａｔｅｗａｙ技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ表达文库。［方法］首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总ＲＮａ并分离纯化ｍＲＮａ，用ｃｌｏＮｅ ｍｉＮｅＲｔｍⅡｃＤＮａ文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ初级文库，然后将ｃＤＮａ从初级文库重组到ｐ ＶａＸ１．０上，构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ表达文库，最后用７个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。［结果］构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ初级文库总容量为０．９２×１０７ｃＦＵ，插入片段平均大小为１．６３ ｋｂ；表达文库总容量为２．３２×１０７ｃＦＵ．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郭俣 刘长青 陆涛峰 佟春玲 修晓娜 关伟军 马月辉
利用SMART技术构建了北京油鸡肝脏全长cDNA文库,构建的未扩增文库滴度为1.96×106pfu·mL-1,文库重组率为92.8%,插入片段长度为1.23kb,扩增文库滴度为1.64×1010pfu·mL-1。设计purH基因保守引物对该文库进行筛选,克隆了北京油鸡purH基因(GenBank登录号:EU334506),将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-N3-purH,将其导入北京油鸡体外培养细胞中。转染后24、48和72h,pEGFP-N3-purH转染率为10.3%～53.2%,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中。随表达量...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黎铭 陈晓汉 熊建华 李咏梅 陈秀荔 蒋伟明 曾地刚 彭敏 马宁 杨春玲
为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆3...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
肖钢 张秀英 张振乾 官春云
以授粉后27d的种子mRNA为目标群体,授粉后7d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2%,片段大小200～600bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵明文 李娜 梁婉琪 王南 张大兵 潘迎捷
根据对韩国灵芝菌丝体、不同发育阶段子实体及孢子粉中灵芝酸含量的测定结果 ,以含量较高的灵芝原基为材料 ,提取mRNA ,从而构建以λZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测 ,所构建文库的滴度达到 6× 10 5pfu·mL-1,重组率达到 96 % ,插入片段的大小均在 70 0bp以上。该表达文库的构建 ,为进一步克隆和鉴定灵芝酸合成的相关基因打下了良好的基础。
关键词：
灵芝酸 原基 cDNA表达文库
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