为探究石金钱龟板来源的寡肽KNGP能否作为COX-2（环氧合酶-2）的新型抑制剂，通过紫外分光光度法测定石金钱龟板肽YPTP、合成肽段KNGP和RG的IC_(50)值，利用内源荧光、同步荧光、三维荧光光谱和ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)荧光探针法分析KNGP对COX-2的疏水性影响，利用分子对接方法分析KNGP与COX-2间的相互作用方式。结果显示，YPTP、KNGP和RG的IC_(50)值分别为0.609、0.046和0.056 mg/mL,KNGP的IC_(50)值低于阳性药布洛芬（IC_(50)=0.217 mg/mL），说明KNGP对COX-2具有显著的抑制潜力。内源荧光结果显示KNGP对COX-2的作用为静态猝灭且有单一作用位点，同时热力学参数计算结果显示，KNGP和COX-2的结合过程中疏水作用是主要驱动力，且KNGP和COX-2结合的是由熵驱动的自发过程。同步荧光、三维荧光光谱和荧光探针结果显示COX-2中的酪氨酸与色氨酸的疏水环境发生变化，且其表面的疏水性减弱。KNGP与COX-2的分子对接显示，KNGP分子主要通过NH基团、C=O结构、吲哚和咪唑结构与COX-2活性中心的氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用，并通过形成静电作用增强结合的稳定性。以上结果表明，KNGP能与COX-2的单一位点通过氢键和疏水相互作用结合形成复合物，并改变酶的二级结构来抑制其活性。

以孔鳐软骨为材料,采用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀,制备孔鳐软骨蛋白;以DPPH·和HO·清除活性为导向,采用胰蛋白酶酶解、膜超滤、DEAE-52阴离子交换层析、Sephadex G-15凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等技术,制备抗氧化肽,并对其活性进行系统评价。结果显示,孔鳐软骨蛋白经胰蛋白酶酶解和分离纯化得到2个抗氧化肽RCPE-A和RCPE-B,经氨基酸序列分析确定其序列分别为Gly-Glu-Glu-Gly-ProArg-Gly (GEEGPRG)和Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL),质谱(ESI-MS)测定其分子量分别为700.71和792.87 u。体外自由基清除实验结果显示,RCPE-A与RCPE-B对DPPH·(EC50 2.94和1.16 mg/mL)、HO·(EC_(50) 0.34和0.54 mg/mL)、ABTS~+·(EC_(50) 0.34和0.10mg/mL)和O_2~-·(EC_(50) 0.11和0.03 mg/mL)具有良好的清除作用,RCPE-A与RCPE-B亦显示出较强的脂质过氧化抑制作用。研究表明,孔鳐软骨蛋白酶解物及制备多肽可用于抗氧化相关的功能食品开发,也可以用作抗氧化剂延长相关产品的货架期。

金钱龟的饲养技术金立成（武汉市永昌野生动物研究所）金钱鱼学名三钱闭壳龟（Ｃｕｏｒａｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ），栖息在华南高山峡谷，植被较好的石缝、湖沼和溪边。金钱龟肉味鲜美，具药用价值，是我国珍稀野生动物．一、金钱龟的生物习性１．栖息的生态环境：金钱龟...

课题组前期利用鲣加工副产物酶解制备了寡肽SEP-3（Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln）。为探究睡眠剥夺时间对小鼠氧化应激水平的影响及鲣寡肽SEP-3对睡眠剥夺小鼠氧化应激的干预作用，采用改良多平台水环境法对C57BL/6雄性小鼠分别进行睡眠剥夺0、48和72 h后，检测血清和肝脏中T-AOC、MDA含量、SOD和GSH-Px活性；然后将C57BL/6雄性小鼠分为正常组、SD组、褪黑素组、SEP-3组和★SEP-3组，除正常组外其余各组均进行72 h的睡眠剥夺，实验期间监测体质量的变化，H.E染色观察肝脏的组织形态，并检测血清和肝脏中T-AOC、MDA含量、SOD和GSH-Px活性。结果显示，与正常组相比，睡眠剥夺48 h后小鼠血清中MDA和SOD的表达水平明显升高，T-AOC和GSH-Px并无明显变化，肝脏中T-AOC、SOD和GSH-Px活性呈现下降趋势，而MDA含量呈上升趋势；睡眠剥夺 72 h，SD组小鼠血清和肝脏中T-AOC、SOD和GSH-Px活性明显下降，MDA含量明显升高。药物干预能显著提高小鼠血清和肝脏中T-AOC、SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。寡肽组间及阳性对照组之间小鼠血清和肝脏中MDA含量，SOD和GSH-Px活性并无显著差异。但在血清中，阳性对照组T-AOC显著高于寡肽组，寡肽组间却无显著差异；在肝脏中，阳性对照组和★SEP-3组T-AOC无显著差异，但均显著高于SEP-3组。此外，药物对睡眠剥夺小鼠体质量无影响，但对肝损伤具有明显的保护和修复作用，且阳性对照组和SEP-3组的效果更好。研究表明，睡眠剥夺72 h后能显著激活小鼠体内氧化应激反应，SEP-3能明显改善睡眠剥夺引起的氧化应激损伤。本研究为治疗睡眠障碍药物或辅助治疗的保健食品的研发提供了一定的理论依据。

以水解度(DH)作为试验的衡量指标,通过对pH值、水解温度、水解时间、E/S等试验条件的考察,并采用L9(34)正交试验确定了pH-stat法制备蛋清高F值寡肽的可控酶解条件。结果表明:碱性蛋白酶最适水解条件为:pH值11,温度45℃,[E]/[S]1.04%,水解压时间5h;风味蛋白酶的最适水解条件为:pH值7.5,温度60℃,[E]/[S]3.3%,水解时间5h。

【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6

为研究草鱼I型呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)非结构蛋白NS12的功能,实验利用酵母双杂交实验、GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)和对GCRV感染过表达宿主蛋白酶体亚基β7(proteasome subunit beta type 7, PSMB7)的草鱼卵巢细胞(grass carp ovarian cell,GCO)中ns12转录水平的表达量进行实时荧光定量PCR检测,研究PSMB7和NS12的相互作用。酵母双杂交实验结果表明,PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12也存在着潜在相互作用。GST-pull-down检测结果证实PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12存在相互作用;PSMB7过表达能够上调ns12在病毒感染过程中的转录水平表达量;免疫印迹验证NS12对于蛋白降解并不敏感。本实验室先前研究证实PSMB7在病毒感染过程中表达恒定。综上所述,这些结果揭示GCRV NS12与PSMB7存在分子间相互作用,但并没有作为PSMB7的底物。表明其可能竞争性地阻碍蛋白酶体复合物的形成。病毒蛋白干扰蛋白酶体复合物胞内PSMB7的积累可能是其一种针对蛋白酶体介导的先天免疫的免疫逃逸策略。

以RAW264.7细胞为实验模型,探讨文蛤寡肽(MMO)在体外的免疫调节作用。实验设立空白对照组、阳性药物组(脂多糖,LPS)及低、中、高浓度MMO组,采用MTT比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期变化,H.E染色观察细胞形态变化,中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力,免疫荧光标记法观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况,硝酸根还原酶法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中一氧化氮、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量。结果显示,MMO能促进RAW264.7细胞的增殖和分化。当MMO浓度为250μg/mL时,增强细胞吞噬能力、增加细胞周期中G1/G0期和G2/M期细胞、诱导iNOS刺激NO释放、促进IL-6和IL-1β分泌效果最为显著,表现出与LPS对RAW264.7细胞相似的激活作用。研究表明,MMO具有促使RAW264.7细胞活化,增强非特异性免疫的潜力。

探讨信息生态环境因子相互作用的范围、实现途径、形式、效果和作用程度,论述信息生态环境因子的相互作用范围包括同类因子的相互作用和异类因子的相互作用,其相互作用是通过信息人间接实现的,有一对一交互作用、一对多同时作用、多对一同时作用、多因子链式作用、多因子环式作用等多种形式,作用效果包括相互限制、相互促进、相互补充、相互替代,在相互作用力度、影响程度、作用效果方面都存在非均衡性。

以带鱼为原料,通过双酶分步水解制备蛋白酶解液,利用活性炭吸附脱除芳香族氨基酸,紫外和氨基酸组成分析测定高F值寡肽(HFP)的F值,并对昆明小鼠体内的活性进行了系统评价。酶解实验结果显示,带鱼蛋白采用胃蛋白酶和风味蛋白酶进行双酶分步水解,胃蛋白酶的最优酶解工艺参数为酶用量3%,料液比1∶5(g/m L),温度35°C,p H 2.0,酶解时间3 h;风味蛋白酶的最优酶解工艺参数为酶用量3%,p H 7.0,温度50°C,酶解时间3 h。活性炭型号筛选和脱芳工艺研究表明,4号粉末活性炭(200目)优于其他4种活性炭,在料液比1∶20(g/m L)、p H 6.0、常温下处理4 h,蛋液的脱芳率最高,F值(OD220/OD280)由脱芳前的5.75增加到脱芳后的30.72。制备的带鱼高F值寡肽经氨基酸组成分析验证,F值(支链氨基酸/芳香族氨基酸)为28.06。活性实验结果显示,与对照组相比,高F值寡肽剂量组昆明小鼠的醉酒时间明显延长,醒酒时间显著缩短,力竭游泳时间明显延长,游泳后的剂量组肝糖原和肌糖原含量增加,血清尿素氮和乳酸含量下降,而乳酸脱氢酶活性则明显提高。另外,剂量组小鼠体内的抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性均显著提高,而丙二醛含量则显著减少。本实验为带鱼高F值寡肽的制备提供技术支持,所制备的高F值寡肽对小鼠具有较好的抗醉酒、醒酒、抗疲劳作用和抗氧化活性。

为研究人工合成的菲律宾蛤仔寡肽体外抗前列腺癌细胞DU-145的活性及作用机制,实验采用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western blot等方法检测人工合成菲律宾蛤仔寡肽作用于DU-145细胞后细胞凋亡率、线粒体膜电位改变、细胞色素C表达、caspase3、caspase9的变化,并用电子显微镜观察细胞超微结构的改变。结果显示,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,DU-145细胞的抑制率逐步增高,当药物浓度为2.5 mg/m L时,24 h抑制率为49.9%±4.1%,72 h抑制率为97.2%±7.3

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白ＶＰ５６与宿主蛋白的相互作用，实验采用酵母双杂交Ｇａｌ４系统鉴定与ＶＰ５６相互作用的草鱼蛋白。首先利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从Ⅱ型ＧＣＲＶ感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因ＶＰ５６，构建Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６诱饵表达载体；在酵母菌株中检测其自激活性后，以ＶＰ５６为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株，并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼ＪａＭ－ａ（ＧＣ ＪａＭ－ａ）基因，并构建Ｐ ＧａＤＴ７－ＧＣ ＪａＭ－ａ载体，在酵母中研究草鱼ＧＣ ＪａＭ－ａ与病毒蛋白ＶＰ５６相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６无自激活作用，可以应用于酵母双杂．．．

以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-P...

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。

小黑杨ＰｓｎＷＲＫＹ７０是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系，本研究以１４０ ｍｍｏｌ／ｌ ｎａ Ｃｌ溶液处理过的小黑杨叶片为材料，利用热稳定核酸酶（Ｄｓｎ）构建了均一化的ＰＧａＤＴ７－ＤＥｓＴ酵母双杂交ＣＤｎａ文库，将ＰｓｎＷＲＫＹ７０基因亚克隆至ＰＧＢＫＴ７载体，形成ＢＤ－ＷＲＫＹ重组质粒，并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交ＣＤｎａ文库。经过２轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验，初步选出了５种与ＰｓｎＷＲＫＹ７０相互作用的蛋白质。对所筛选出的５种蛋白质进行保守结构域分析发现：有２种预测蛋白（ＨＰ１和ＨＰ２，其中Ｈ．．．