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[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋杨 张艳敏 刘美艳 王传增 刘金 冯守千 王延玲 陈学森
【目的】克隆短枝型苹果(Malus domestica Borkh.)的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因:MdRGL1a/b、MdR...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王延玲 张艳敏 冯守千 田长平 王海波 刘遵春 宋杨 陈学森
【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈婷婷 孙庚 刘金亮 孙明洋 胡瑞学 张世宏 潘洪玉
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)有性生殖决定着菌核病的初侵染及流行程度,有性生殖过程中的交配型基因对该菌的性别控制和遗传进化起着决定性作用,为揭示核盘菌有性生殖的分子机制,本研究对核盘菌的交配型基因MAT-2进行了克隆、序列分析及其原核表达的研究。根据GenBank中核盘菌MAT-2基因(DQ159959)序列设计引物,提取该菌总RNA,采用Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)的方法扩增交配型基因MAT-2,对其进行序列分析,构建其原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。以反转录产物为模板,扩增出1...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王丽华 李杰勤 詹秋文 樊飞飞
以高粱品系早亨加利为材料,通过RT–PCR扩增,克隆高粱Sb CAD4基因。测序结果表明,克隆的Sb CAD4基因与NCBI基因库中高粱IS11861品系只在编码序列第548位有1个碱基的差异,而二者的氨基酸序列完全一致。进化树分析结果表明,Sb CAD4与拟南介、水稻、玉米的木质素合成CAD基因位于同/L1个群中。比对分析结果表明,Sb CAD4与木质素合成基因具有相同的结构域。将构建正确的重组质粒(p MAL–Sb CAD4)转化入大肠杆菌菌种BL21中进行诱导表达的结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L。经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,Sb CAD4融合蛋白...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱忠珂 王建华 汪儆 张春雷 蔡青和
为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...
关键词：
犬溶菌酶基因 犬溶菌酶 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
王亚男 梁岩岩 严文培 张银萍 李强 吴秀菊
为进一步挖掘甲基丁香酚合成相关酶基因，解析北细辛次生代谢途径，根据北细辛转录组数据库信息，筛选和克隆了AhOMT1基因，并进行了相应的生物信息学分析及原核表达分析。结果表明，AhOMT1基因包含的开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸，理论分子质量为40.23 ku,等电点为5.34,AhOMT1蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽序列；AhOMT1基因具有二聚化结构域与甲基转移酶结构域，AhOMT1与催化类黄酮、丁香酚类化合物的O-甲基转移酶的同源性较高；构建pET-32b-AhOMT1原核表达载体，成功诱导表达约60 ku的重组蛋白；确定了最佳诱导条件是0.2 mmol/L IPTG,16℃诱导16 h,该诱导条件下的重组蛋白多以可溶性蛋白形式存在；使用Ni~(2+)树脂分离纯化AhOMT1蛋白，以200 mmol/L咪唑洗脱可得到最大量的蛋白。该研究首次克隆了北细辛AhOMT1基因，构建原核表达载体，筛选出AhOMT1蛋白最佳诱导条件。
[期刊] 水产学报
[作者]
王改玲 王明成 李传凤 潘磊 刘盼婷
为研究草鱼抗菌肽NK-lysin基因的组成结构、在组织中的表达差异及其抑菌活性,实验根据已知鱼类NK-lysin基因保守区序列设计上下游引物,采用RT-PCR和RACEPCR技术克隆草鱼NK-lysin基因(Cinkl),RT-PCR进行各组织间的表达分析,并构建Cinkl成熟肽的原核表达载体,采用琼脂糖孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性。结果显示,Cinkl c DNA全长768 bp,编码121个氨基酸;基因组DNA全长3 361 bp,包含4个外显子和3个内含子。经多序列比对分析和结构域预测表明,Ci
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘萍 马晓霞 周小凯 马鹏 常秋燕 李林杰 李凌浩 马忠仁
为了研究流产衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫原性,建立快速有效的流产衣原体抗体检测方法,根据Gen Bank中公布的流产衣原体基因组序列,设计并合成了流产衣原体CPAF蛋白编码基因的特异性引物,以流产衣原体标准菌株基因组为模板,经PCR扩增获得长度为1 809 bp目的基因片段;对获得的目的基因进行测序,并用生物信息学软件进行预测分析;再将该片段插入原核表达载体p ET-30a中,经双酶切、测序鉴定;构建成功的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,通过对诱导条件的优化,确定诱导表达的最佳条件,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示,成功克隆流产衣原体CPAF蛋白的编码基因,该编码产物可能是定位于宿主细胞质中的一种衣原体分泌性蛋白酶,分子内具有多个可能的抗原表位;重组表达质粒经IPTG诱导后,表达分子质量为67.6 ku的CPAF蛋白,该重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体以及流产衣原体阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。结果表明,以大肠杆菌表达系统重组表达的流产衣原体CPAF蛋白具有良好的免疫原性,可作为动物流产衣原体病的血清学诊断及亚单位疫苗研究的候选抗原。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨志刚 姚琴琴 成永旭 施秋燕 杨青 何杰 马明君 王瑶 常东
根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ６去饱和酶基因（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＪＸ９４６４３４）及菁夜蛾去饱和酶基因（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＪ６２２０５５．１）的保守区设计引物，通过逆转录Ｐｃｒ以及ｒＡｃｅ技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ６去饱和酶基因ＦＡＤ６－ｂ的全长序列。经序列分析，中华绒螯蟹ＦＡＤ６－ｂ ｃＤｎＡ全长为２ ３１０ ｂＰ，其中开放阅读框（ｏｒＦ）为１ ３２６ ｂＰ，共编码４４２个氨基酸（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＰ８７６０５８），理论分子量为５０．８６ Ｋｕ，理论等电点为８．４７，ＦＡＤ６－ｂ基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ６去饱和酶基因的一致．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周晓卉 黄丽华 蒋向 李育强 张学文
【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1821bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
葛淑敏 张淑华 何秀霞 于源华 钱爱东
【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可...
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢立兰 安康 陈力 孙紫德 方六荣
DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(Ge
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘裕峰 朱天辉 刘应高 谯天敏 李姝江 龙旭梅 韩珊
为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴玉丹 王文兵 李兵 王东 沈卫德
【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术(RLM-RACE)克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列(GenBank登录号:EF428980)。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1047bp,其中780bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6kD,等电点(pI)为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P3.0Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Coc...
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