【目的】采用睾丸注射慢病毒的方法生产转基因鸡以提高转基因效率，使转基因鸡的批量生产变得简单可行。【方法】用磷酸钙沉淀法包装慢病毒，对慢病毒包装体系中的质粒总量和HN Buffer的pH值进行优化，以包装出滴度较高的慢病毒；然后将慢病毒注射到受精鸡蛋的胚胎中验证其活性；最后，将慢病毒注射到8日龄公鸡的睾丸内，待其性成熟以后，将精液DNA呈阳性的公鸡与非转基因母鸡进行交配生产出转基因鸡。【结果】当90 mm培养皿中质粒总量为50 μg、HN Buffer的pH值为7.05时慢病毒的包装效率最高，在该条件下包装出的慢病毒滴度高达7.5×107 TU/mL；采用慢病毒胚胎注射途径成功地生产出增强绿色荧...

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②(Ⅰ:1#♂×7♀、Ⅱ:2#♂×7♀、Ⅲ:3#♂×7♀、Ⅳ:4#♂×7♀)其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下...

为了研究中药与西药奥司他韦(达菲)抗鸡新城疫病毒效果的差异,用珍珠草、华荠苧2味中药制成注射液,采用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,检测中药与西药注射液对鸡新城疫病毒的抑制作用。结果表明,中药注射液对鸡胚无毒性作用,并且从鸡胚死亡数、活胚数和HA滴度等方面比较,中药与西药抗病毒效果无差异。表明二者抗病毒效果相似,均能完全抑制鸡新城疫病毒在鸡胚中增殖。

【目的】研究IGF2b基因对建鲤生长及体型的影响。【方法】用含有IGF2b基因的慢病毒载体注射建鲤背部肌肉组织,注射量分别为10,20和40μL/尾,阴性对照组不进行任何处理,阳性对照组注射20μL/尾去离子水。在相同饲养条件下饲养满9个月后,分别测量建鲤的各项生长指标。【结果】注射IGF2b基因的建鲤体质量、体长、体高、体厚、尾长均显著大于阴性对照组和阳性对照组,说明IGF2b基因在建鲤背部肌肉组织中过表达对鲤第2阶段生长同样具有促进作用,IGF2b基因在鲤背部肌肉组织中过表达对鲤的体型也有一定的作用。鲤的体长、体高、体厚的3D图也说明,随着IGF2b基因注射,鲤鱼倾向于具有更大的体长、体高...

本研究以绿色荧光蛋白为报告基因,转染兔卵母细胞,探索建立操作方便、效率高、成本低、可定量生产转基因兔的可行性方法。选择14只成年新西兰雌兔,每侧卵巢内分别打点注射0.25 mL 0.5~0.8 mg/mL的质粒,注射后第3日、第16日和第31日进行人工辅助配种;卵巢注射后第3日、第16日和31日随机各取1只雌兔卵巢做冰冻切片,置荧光显微镜下观察绿色荧光;应用PCR和Southern杂交检测转基因新生仔兔阳性率。结果经荧光显微镜观察,卵巢注射后第3日配种的雌兔卵巢冰冻切片及48 h以后的胚胎呈现绿色荧光;卵巢注射报告基因后第3日配种的雌兔后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测结果分别为...

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药蛇附子注射液对伪狂犬病病毒的抑制作用。试验共分4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药蛇附子注射液,HA滴度0。第Ⅱ组接种病毒尿囊液与磷酸奥司他韦,HA滴度0。第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水,HA滴度7 log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度0。结果表明,中药蛇附子注射液对鸡胚无毒性作用。中药蛇附子注射液与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制伪狂犬病病毒在鸡胚中增殖。

【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基...

研究了移植方法和培养液对显微注射法生产转基因小鼠的影响。结果表明 ,小鼠受精卵显微注射外源基因后 ,进行单、双侧输卵管移植 ,受体的妊娠率分别为 34.4 %和 37.5 % (P>0 .0 5 ) ,差异不显著 ;但仔鼠成活率分别为 83.6 %和 97.2 % (P

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为:100μL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子(109个/mL)给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件(100μL慢病毒原液(...

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。

以鱼类胚胎细胞和胚胎干细胞为核供体进行细胞移植构建鱼类嵌合体研究方面,现有的成功报道均采用显微注射方法;在转基因海水鱼类研究中,显微注射也是最为常用的技术,本实验室在花鲈胚胎干细胞嵌合体构建和外源基因向花鲈胚胎的转移研究中取得的结果也充分证实,显微注射技术是开展海水鱼类细胞移植和转基因研究的首选技术。

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在072 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克

[目的]研究低氧环境下改变种蛋内铜离子（Cu~(2+)）含量对藏、肉鸡两品种鸡胚发育、血管生成和机体抗氧化性能的影响，并探讨其影响机制。[方法]选择重量相近的藏鸡、科宝肉鸡种蛋各132枚，随机分为3组。孵化前蛋内注射不同Cu~(2+)浓度的CuSO_(4)注射液100 μL，对照组0 μg·mL~(-1)（注射100 μL 体积分数为0.9% Nacl溶液），低剂量组75 μg·mL~(-1)，高剂量组300 μg·mL~(-1)，低氧环境下孵化。12胚龄时固定和采集尿囊膜，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对鸡胚尿囊膜血管面积、条数进行测量；记录出雏率，采集1日龄血清及各组织并测定其重量；使用试剂盒检测与抗氧化相关的指标；采用实时荧光定量PCR检测肝脏和尿囊膜中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的表达。[结果]与对照组相比，肉鸡出雏率与蛋内注射Cu~(2+)浓度呈正相关，低剂量组出雏重/蛋重、腿体比以及高剂量组肝体比均显著提高（P < 0.05）；藏鸡低剂量组肝体比显著高于对照组（P < 0.05）。肉鸡高剂量组的尿囊膜血管面积和中血管数显著增加（P < 0.05）；高剂量的CuSO_(4)能促进藏鸡尿囊膜上大、中、小血管的形成并增加血管面积（P < 0.05），低剂量组的藏鸡尿囊膜中、小血管数量显著增加（P < 0.05）。藏、肉鸡试验组血清中铜锌超氧化物歧化酶（Cu, Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD）活力均显著高于对照组（P < 0.05），丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量显著低于对照组 (P < 0.05)，而谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活力不受Cu~(2+)的影响。注射高剂量的CuSO_(4)能显著上调藏、肉鸡肝脏和尿囊膜中VEGF基因的表达（P < 0.05），且藏鸡尿囊膜和肝脏中VEGF基因的表达均显著高于肉鸡（P < 0.05）。[结论] 低氧环境下种蛋内注射CuSO_(4)可提高藏鸡和肉鸡机体的抗氧化能力，促进两品种鸡胚血管生成以应对低氧环境；两品种间肉鸡机体抗氧化能力强于藏鸡，而藏鸡的血管生成能力强于肉鸡。

为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1 220 bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300 bp和900 bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。