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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘艳丽 姚家玲
以盾叶薯蓣叶片、种子愈伤为材料,探讨了不同的酶浓度、酶解时间及渗透压对原生质体分离的影响。结果表明:生长5~10 d的叶片置于0.6%纤维素酶、0.5%果胶酶、0.9 mol/L甘露醇的酶液中、黑暗处理21 h,其原生质体产量和活力最高;悬浮培养5~10 d的愈伤组织在2.0%纤维素酶、1.0%果胶酶0、.7 mol/L甘露醇的混合酶液中黑暗处理6~8 h原生质体产量和活力最高。
关键词：
盾叶薯蓣 原生质体 分离
[期刊] 湖南农业大学学报
[作者]
徐向丽 刘选明 周朴华 易克 朱至清
用 3种不同的繁殖技术进行盾叶薯蓣组织培养 ,其中以离体诱导微块茎的形成为最有效的方法 .BA与 KT质量浓度分别为 4.0～ 8.0 ,1 .0～ 2 .0 mg/ L时 ,最有利于盾叶薯蓣微块茎的形成 ,将之接种到含有 NAA的培养基上后易生根形成小植株
关键词：
盾叶薯蓣 组织培养 微块茎 诱导
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘洁茹 冯露 林启芳 周杨 池秀凤 蔡明 程堂仁 王佳 张启翔 潘会堂
[目的]研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。[方法]以F_1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度(5,10,15,20,25,30 g/L)及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶(10,20,30 g/L)、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇(PEG)介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。[结果]分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15～20 g/L,离析酶质量浓度为5～10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×10~5 g~(-1),破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。[结论]获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。
关键词：
紫薇 酶解法 叶片原生质体 瞬时转化
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李正红 孙振元 刘秀贤 彭镇华
用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析,对不同材料原生质体得率进行比较,对提取的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养,对原生质体形成的愈伤组织以MS和改良B5培养基附加不同浓度NAA、6 BA、2,4 D、PEG、KT、ZT等进行分化培养。试验结果表明:纤维素酶对原生质体提取得率有极显著影响,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为:纤维素酶0.5%、果胶酶0.3%、甘露醇0.6mol·L-1、酶解8h;不同材料原生质体提取得率有显著差异;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生...
关键词：
地锦 五叶地锦 原生质体 培养
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
付春华 郭文武 邓秀新
原生质体是植物遗传改良的重要实验体系之一,而原生质体的分离是该体系的基础。对柑橘叶肉原生质体来说,柠檬、橙类等品种的叶肉原生质体比较容易分离,而柚类、橘类等柑橘品种则相对困难。本研究采用椪柑、黄岩本地早、沙田柚、冰糖橘4个品种为试材,枳壳试管苗为对照,系统研究了不同基因型、不同叶龄、不同酶种类、不同酶液组合对叶肉原生质体分离的影响,探讨了影响柚类、橘类等柑橘叶肉原生质体分离的因素,从中找出了各品种较适宜的分离条件。在适宜条件下,4种供试品种的原生质体得率(FW)可达10×106~20×106g-1。
关键词：
柑橘 叶肉原生质体 分离
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
胡建斌 李静 李琼 孙治强
以盾叶薯蓣的叶片制备ISSR-PCR DNA模板。通过单因子试验分别研究了模板DNA质量和浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度以及退火温度对盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增的影响,建立了适宜于盾叶薯蓣的ISSR反应体系和扩增参数,即15μL反应体系中包括:20 ng/L模板DNA,1×Taq酶缓冲液,1.0 UTaq聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物和0.3 mmol/L dNTPs。并从46个ISSR引物中筛选出10个带纹清晰、多态性丰富的引物,并确定了这些引物的适宜退火温度。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘艳丽 姚家玲 张友德
以试管培养的盾叶薯蓣为材料 ,研究了基因型、外植体种类、光暗培养条件、激素配比等因子对其愈伤组织诱导的影响。结果表明 :不同基因型盾叶薯蓣的愈伤组织诱导率有较大差异 ;同一基因型 ,4种外植体(微块茎、幼芽、叶片、胚 )的愈伤组织诱导率有所不同 ,胚和微块茎易诱导出愈伤 ,幼芽居中 ,而叶片较难 ;光暗培养条件下不同外植体的愈伤组织诱导率有差异 ,暗培养对叶片愈伤诱导有利 ,而光培养有利于微块茎愈伤组织的形成 ;2 ,4 -D可以诱导微块茎、幼芽、胚形成愈伤 ,但 6 -BA和 2 ,4 -D的组合可以显著提高愈伤组织诱导率。叶片愈伤组织的诱导需要添加NAA和 6 -BA。
关键词：
盾叶薯蓣 组织培养 愈伤组织
[期刊] 水产学报
[作者]
谢恩义 马家海
为了开发礁膜人工育苗的新技术,以4％果胶酶和2％纤维素酶的甘露醇溶液,分离酶解经无菌处理的礁膜叶状体,在40mmol·L~(-1)CaCl_2,0.7mol·L~(-1)甘露醇,pH5.5,温度28℃,摇床速度50r·min~(-1)旋转振荡3h的条件下,1.0g湿重礁膜可获原生质体约2×10~6个。原生质体分离后依次用比重为1.030、1.026、1.022的消毒海水(添加N、P、Fe~(2+)、IAA、KB、Vit C)培养,2d后已形成明显的再生细胞壁,3～4d后细胞开始分裂,8d后形成由4～8个细胞组成的细胞团,以后原生质有不同的发育形态,较常见的是形成由一共同胶质膜包被的类似亲本的叶...
关键词：
礁膜 原生质体 酶解 分离 培养
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
吕长平 石雪晖 徐艳 叶云
为建立良好的刺葡萄原生质体分离体系,利用原生质体融合技术对刺葡萄进行品种改良,以刺葡萄叶片、根尖和愈伤组织为材料,研究了经不同酶液组合和酶解时间处理,再经过0.45μm筛网过滤,1000r/min低速离心后分离产生原生质体的情况.试验结果表明,原生质体分离材料以愈伤组织最好,叶片次之,根尖最差;4次以内继代培养的愈伤组织,经2%纤维素酶+0.5%果胶酶+1%离析酶的酶液组合酶解8h后,原生质体的产量为5.12×106个,活力为88.57%.
关键词：
刺葡萄 原生质体 分离 酶液
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贺涵 阳习鹏 赵婉欣 邵雪花 杨凤玺 刘传和
【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L9(33)分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L_9(3~3)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10~6～1.93×10~6 g~(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%～87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10~6 g~(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化p AN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李青 鱼海鹏 张子豪 孙正文 张艳 张冬梅 王省芬 马峙英 阎媛媛
【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl_2会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L~(-1) CaCl_2的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L~(-1)甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L~(-1)甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40%PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10~6个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。
关键词：
棉花 TM-1 原生质体分离 瞬时表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
周宇波 柳俊 谢从华 蔡兴奎
试验以马铃薯试管苗叶片为原生质体来源 ,通过研究材料预处理方法对原生质体产量和质量的影响 ,培养方式及培养基中糖醇与细胞分裂和愈伤组织形成的关系 ,优化并建立了高效稳定的原生质体培养体系 ,获得了 2个双单倍体系的叶肉原生质体再生植株
关键词：
马铃薯 原生质体 培养体系
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
蔡兴奎 柳俊 谢从华
以马铃薯栽培种“中薯2号”的无性系3#、8#和野生种Solanum chacoense叶肉原生质体为融合试材,优化马铃薯高效融合的电融合参数。研究表明,在交变电场(AC)100 V/cm、AC作用时间20 s、直流脉冲电压(DC)1 100 V/cm、DC脉冲时间60 μs、脉冲数1次时,双核融合率可达40％以上。融合产物经过4-5个月的培养获得再生植株。对首先再生的15个株系通过RAPD标记检测,证明均为体细胞杂种。所用引物C-01能够同时扩增出杂种植株中双单倍体亲本11 00 bp和670 bp的特征带以及野生种S.chacoense亲本510 bp的特征带。
关键词：
马铃薯 电融合 体细胞杂种 RAPD
[期刊] 林业科学
[作者]
谷战英 杨若楠 陈昊
【目的】探索油桐叶肉细胞原生质体分离的最适条件,建立油桐原生质体的遗传转化体系,使在油桐体内研究自身基因的功能成为可能。【方法】以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料,通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体并确定最适分离条件。在此基础上,以获得的原生质体为受体系统,建立PEG介导的油桐原生质体基因转化方法。【结果】原生质体分离结果表明,酶解时间对原生质体产量和活性的影响最大,其次是纤维素酶浓度,而离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响较小。以成熟叶片为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度1.
关键词：
油桐 原生质体制备 遗传转化 亚细胞定位
[期刊] 林业科学研究
[作者]
阙国宁 诸葛强
以牡竹属黄竹（ＤｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓｍｅｍｂｒａｎｃｅｕｓＭｕｎｒｏ）的竹节及无菌苗根颈为外植体，培养于含有５ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ、０．２ｍｇ／ＬＫＴ和２００ｍｇ／ＬＬＨ的ＭＳ培养基上诱导愈伤组织，然后移至相同成份或不同浓度２，４－Ｄ的液体培养基中，进行悬浮培养，以建立分散性良好的悬浮细胞系。利用悬浮细胞和无菌苗叶片经酶解获大量原生质体，其产量分别约为每克鲜重２．５×１０５个和５×１０５个，活力均可达８０％。
关键词：
黄竹,细胞悬浮培养,原生质体分离
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