运用PCR技术,实现了对相似穿孔线虫单条虫ITS区域的扩增,通过基因测序以及与GenBank中rDNA序列的比较,结果显示GFCh、HANh、GZll和GZlbs 4个种群的序列与GenBank中Radopholus similisThrone序列具有高度同源性。聚类分析表明,这4个种群可能有着不同的地理来源。

【目的】建立直接从多种线虫混合样品以及香蕉和红掌根组织中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。【方法】使用Primer Premier 5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计1对特异性引物,运用PCR技术对目的线虫DNA进行特异性检测。【结果】通过对17种24个种群线虫的检测表明,所设计的引物只能从香蕉穿孔线虫种群中特异扩增出rDNA-ITS片段,产物大小为518 bp。利用该特异引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系,可以直接从香蕉穿孔线虫与短体线虫、螺旋线虫、肾状线虫、根结线虫、茎线虫、矮化线虫、纽带线虫、丝尾垫刃线虫、滑刃线虫和小杆线虫混合样品中特异扩增出目的线虫的rDNA-ITS片段,并可以...

利用从进口观赏植物上截获的相似穿孔线虫6个种群,采用胡萝卜愈伤组织长期培养和温室盆栽的方法,观察不同培养方法对相似穿孔线虫致病力的影响.结果表明:在胡萝卜愈伤组织上长期培养和在寄主植物上接种复壮后的相似穿孔线虫均对红掌有致病性,但致病力有差异并发生变化;接种线虫后红掌根部发病率最低的为24.40%、最高的为90.00%,繁殖倍数最低的为0.20、最高为2.80;在胡萝卜愈伤组织上长期培养后6个种群的致病力降低,在寄主植物上接种复壮后致病力会增强,但至少要连续复壮2代致病力才能稳定.

【目的】相似穿孔线虫(Radopholus similis)是中国一类检疫对象,随着国际贸易日益加剧,该线虫传入中国的风险也日益加大,急需对其适生性进行分析。【方法】利用已广泛用于物种潜在分布预测的GARP与MAXENT两种生态位模型预测相似穿孔线虫在中国的适生区,并对预测结果进行了阈值依赖和非阈值依赖比较。【结果】两个模型均能较好地预测相似穿孔线虫的潜在地理分布;预测在中国适生区主要分布在南方各省,包括海南、广东、福建、云南、台湾等省区;经检验MAXENT预测结果较GARP好。【结论】相似穿孔线虫可随花卉苗木的国际运输传入中国,并可在中国南方沿海地区及花卉进出口大省云南省等地区发生;上述地区...

穿孔病是桃树常见的病害，分为细菌性穿孔病（bacterial＿shot-hole＿disease,BSD）和真菌性穿孔病（fungal＿shot-hole＿disease,FSD）。大多数果农凭借经验难以准确识别两种病害，因而贻误防治，造成减产。为解决这一难题，提出了基于Mask RCNN(mask region based convolutional neural network)的桃树穿孔病检测方法。该方法对Mask RCNN模型进行了三方面的改进：首先，将Sim-AM(simple,parameter-free attention module)机制融入到残差网络的每一层，使用能量函数对神经元分配三维权重，增强对穿孔病关键特征的提取能力；其次，对RPN网络重复计算识别框进行简化处理，从9种Anchor Box降为3种，提升计算效率；再次，用软性非极大值抑制算法（Soft-NMS,soft non-maximum suppression）替换NMS算法进行Anchor Box选取，提高对遮挡病斑的检测效果。该研究使用二次迁移学习法对模型进行训练，首先利用Kaggle平台上公开苹果叶穿孔病数据集进行训练学习，然后利用两个数据集具有相似特征空间这一特点，在自建桃树穿孔病数据集上进行二次迁移学习，提高了检测准确率。实验结果显示，改进后的Mask-RCNN模型对桃树穿孔病全部类别平均检测精度mAP达到94.1%，召回率达到93.5%。

通过盆栽试验,测定了杀线虫剂克线磷、福气多、涕灭威、卡线特对红掌相似穿孔线虫病的防治效果。结果表明:红掌在被相似穿孔线虫侵染前或侵染后,在根际土壤中施用供试药剂,均能有效防止病害的发生,且在侵染前用药防治效果更好;每盆施用克线磷1.2 g、福气多1.5 g和涕灭威0.9 g,不仅能有效地杀灭红掌根和根际介质中的相似穿孔线虫,且能将病级控制在1以下;在红掌被相似穿孔线虫侵染发病的情况下,施用上述药剂虽然也能有效地杀灭线虫,但因施药前红掌根部被线虫侵染而严重腐烂,故对植株病情的恢复效果较差;卡线特对红掌有药害,不宜用于红掌相似穿孔线虫病的防治。

【目的】玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫，可侵染多种禾本科作物的根部，玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系，以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫，为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫；选取13条含有10个碱基的随机引物，采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析，筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段，并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物；采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】通过RAPD比对分析，发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段；将该片段回收测序，根据片段序列信息，利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1；特异性检测结果表明，HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段，其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带；以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时，特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段，而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段；该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的；对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试，表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力，检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术，可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测，对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力，检测引物特异性强，检测方法便捷稳定，灵敏度高。

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5′-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3′,下游引物:5′-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3′),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段。该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来。在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出...

温室内对香蕉穿孔线虫在无植物及其组织土壤中的存活能力进行了观察和测定。结果表明:在8~38℃环境下的潮湿土壤中(湿度为50%~100%),所有供试7个种群至少能存活5个月,多数种群可存活6~9个月,个别种群可存活11个月;种群间在同一种土壤中的存活力有差异,同一种群在基质土和蕉园土中的存活力差异不显著;在存活虫态方面,多数种群雌虫最多、存活时间最长,雄虫次之,幼虫则很少,但也有少数种群的雄虫存活力强于雌虫;在8~38℃环境下的干燥土壤中(湿度为6%~10%),供试的9个种群存活时间不超过20 d;各种群在干燥基质土的存活能力强于干燥蕉园土,存活的虫态多数是雌虫,雄虫很少,未见幼虫。

为了获取准确、快速检测松材线虫的方法,利用纤维素酶活性、苯乙酸与苯甲酸含量和显色剂检测松材线虫的方法进行了比较研究.纤维素酶活性检测结果为病树与健树酶活性差异显著.病树的光吸收值与健树的光吸收值差异不显著,但测定结果不稳定.显色剂测定病树内与健树内的显色差异明显,病树的显色结果呈深红色至浅红色,线虫愈多色泽愈深;健康材呈无色,感染拟松材线虫的松材呈清白色或无色.显色剂检测是简单、快速和有应用价值的方法.

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行...

【目的】建立松材线虫微滴式数字PCR检测体系，验证该检测体系的有效性，为松材线虫检测提供一个更精确灵敏的定性检测方法。【方法】基于松材线虫16S rDNA基因序列，使用在线工具设计特异性引物和探针。优化PCR反应条件，明确微滴式数字PCR的最佳反应条件。再以采集自不同地区的6株松材线虫和12株拟松材线虫、滑刃线虫、伞滑刃线虫、垫刃线虫的基因组DNA溶液为模板对该体系的特异性进行检测；以稀释10倍的标准DNA为模板，设置不同浓度梯度来验证该体系的灵敏度；以3个不同浓度的DNA标准品稀释模板检测微滴式数字PCR的可重复性。最后以人工模拟添加线虫样品和感病松木样品DNA提取液为模板对该体系的实用性进行验证。【结果】1）设计了松材线虫特异性引物探针一组，引物：P1904-F、P2057-R；探针：Probe-1938。2）PCR反应体系经优化，确定其最佳退火温度为55 ℃。3）特异性验证表明，设计的引物探针可以将松材线虫与其他相近种的线虫区分开。4）灵敏度检测结果发现，该检测体系的检出浓度在0.51～20 000 copies/μL。5）对3组不同浓度标准样品的可重复性检测发现，该检测体系的变异系数在0.31%～9.12%之间，并且样品浓度与变异系数呈负相关。6）使用该检测体系检测林间感病松木样品和人工模拟加入松材线虫的样品发现，该检测体系能够特异地检测出样品中的松材线虫，且拷贝数与样品中的线虫量呈正向相关。【结论】本研究建立了松材线虫微滴式数字PCR检测体系，该方法特异性好，检测灵敏度高，变异系数小，可高效地检测出样品中的松材线虫。该体系的建立可为松材线虫病理学和生态学研究提供可靠的研究数据。

【目的】通过研究cathepsin B基因对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)繁殖力的影响,探索cathepsin B基因的功能,为利用该基因防治香蕉穿孔线虫和植物寄生线虫组织蛋白酶的进一步研究提供科学依据。【方法】根据已知香蕉穿孔线虫cathepsin B基因(Rs-cb-1)的序列,从香蕉穿孔线虫克隆cathepsin B基因,以含有目的基因的质粒DNA为模板合成特异的双链RNA(dsRNA),采用dsRNA浸泡的方法对香蕉穿孔线虫进行RNA干扰(RNAi)试验,通过室内接种胡萝卜愈伤组织繁殖线虫的方法,研究cathepsin B基因的沉默效应对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响。...

采用胡萝卜片愈伤组织接种培养法,在室内条件下对供试香蕉穿孔线虫10个种群的耐寒性进行了测定。结果表明,在12℃和10℃低温下分别处理15 d2、5 d、35 d后,供试香蕉穿孔线虫各种群生活力虽然有所下降,但仍然能够保持一定的繁殖能力;而在8℃时,各种群生存能力明显下降,有些种群无法在此温度下存活。8℃处理15 d后,Rs6种群无法存活;处理25 d后,Rs 2种群亦无法存活;处理35 d后,Rs8、Rs4种群无法存活。Rs1、Rs3、Rs5、Rs7、Rs9和Rs10等6个种群在8℃低温下处理35 d后仍然能够存活。

【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫DNA的方法。【方法】运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫DNA的方法,并通过普通PCR与环介导等温扩增(LAMP)对提取的DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫DNA的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%(W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的CTAB法和蛋白酶K法比较,Chelex-100法提取的DNA得率高,相同条件...